1.iTRAQ背景介绍

1994年，Marc Wilkins在Siena双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）会议上最早提出了蛋白质组（proteome）概念，并于1995年7月的Electrophoresis杂志上发表。随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，人们不再满足于对一个细胞或组织的蛋白质进行定性研究，而是着眼于蛋白质量的研究，于是蛋白质组学概念就被提出，并得到了广泛的应用。

蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。目前最新的iTRAQ蛋白定量分析技术在此基础上被提出，并被得到广泛应用。

蛋白组学中的方法一直在不断提高。基于高度敏感性和精确性的串联质谱方法，不需要凝胶，就可以获得相对和绝对定量的蛋白质结果。iTRAQ和iCAT是这些新进展中的两大主力，但是，新技术也有不尽如人意的地方，需要不断改进。

iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术，是一种新的、功能强大的可同时对四种样品进行绝对和相对定量研究的方法，这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。

2.iTRAQ的原理
iTRAQ的检测可以做这样的比喻，蛋白被打成肽段后，被平均的铺在了一个有384个孔的平板上，然后机器会从每个孔中选取浓度在前5名的蛋白进行鉴定和比对，所以，如果假设每个一个样本中有100个蛋白，他们的浓度均为1%，那么得到的结果就是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，可以达到90以上；如果一个样本中有100个蛋白，有3个蛋白的含量分别为30、20、10、其他的97钟蛋白为剩下的50%，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有50或者60个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。 

3.iTRAQ的主要优势   

①高通量

一次性定性和定量该样本的总蛋白，不用像双向电泳(2DE)或DIGE要逐个斑点做鉴定；2DE可分离1500-2500个斑点(并且可能很多斑点对应

②对样本类型无限制

任何类型的样本均可做，当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多；对于罕见物种，可提供转录组数据来检索，更容易找到有意义的蛋白。

③加了数据的可靠性和相关性

一次上机的样本数高达8个，如果样本数多于8个，还可以在每次上机时设置内参，每个样本先跟内参比较，再相互比较(排除操作、环境和仪器误差)，从而实现多组样本间的差异蛋白分析。 

④结果直观、分析灵活

直接得到蛋白的定性和相对定量信息，可利用统计学方法快速筛选出各个组别的差异蛋白；能更好的结合基因组或转录组的数据，十分有利于后续研究。

4.iTRAQ与其他蛋白质组学技术的区别是什么？

双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术，适用于大部分样本，只是对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好；另外由于各个样本需要单独跑胶，很难避免操作误差对结果的影响，可能导致定量不准确；但是双向电泳的服务价格相对便宜，可以用于样本差异的初步筛选；

DIGE在双向电泳基础上做了改进，引入了荧光标记物和内标，可以使定量更加准确；但该技术也是依据蛋白的等电点和分子量分离，因此对强酸或强碱性蛋白，以及分子量太大或太小的蛋白质分离效果也不好。

iTRAQ、TMT、label-free和SILAC都是利用液质联用技术来寻找差异蛋白。其中，iTRAQ和TMT的原理和检测方法基本一致，只是使用了不同的标记物；TMT有10种标记物，可对多达10种不同样本进行分析，但是由于其标记物的质量数非常相近，因此必须使用超高分辨率的质谱才可以满足检测，这也必然会导致信号干扰更多，可能会影响定量的准确性；label-free是非标记的蛋白质组学技术，由于没有标记物，其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性，该技术鉴定到的蛋白数目会少于iTRAQ技术，并且定量的准确性较差，优势是服务费用较低；SILAC是基于稳定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法，利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞，达到体内标记的目的，其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高；但是由于缺乏合适的同位素培养基，该方法基本只能用于可传代的哺乳动物细胞系。

从定量准确性、应用性等各方面综合考虑， iTRAQ技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学技术。