放射性研究表明，真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。这一关键的翻译后修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。在评估磷酸化时，选择的方法可能会有所不同，这取决于多个因素，包括提出的具体问题以及特殊仪器或试剂的可用性。如何检测蛋白质磷酸化，本文简要介绍了几种常用方法，并提出了每种方法的优点和缺点。

western Blot

Western blot是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，大部分细胞生物学实验室都拥有开展这些实验的设备。利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Western blot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。许多磷酸化特异抗体十分灵敏，可轻松检测常规样品(如10-30 µg细胞提取物)中的磷酸化蛋白。

酶联免疫吸附分析(ELISA)

ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。ELISA的定量能力优于Western blot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。

激酶活性分析

蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，它们影响了众多负责生物反应的下游效应物，因此，评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。

磷酸化特异抗体的开发

直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育，获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳，这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。鉴于这些方法很费力，磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。

细胞内流式细胞术和ICC/IHC

传统的细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学(ICC/IHC)是检测磷酸化事件的有力工具。流式细胞仪利用激光来激发用于抗体检测的荧光染料。在评估同一个细胞中的多个蛋白时，必须精心选择滤光片组合和荧光染料，其光谱不能重叠。流式细胞术很有优势，因其实现了快速、定量的单细胞分析。通过细胞表面标志的分型可检测异质群体中特定细胞类型的蛋白，而无需在物理上分离细胞。通过这种方法可分析稀有的细胞群体，而不用担心细胞损失或细胞分选过程中可能发生的蛋白表达变化。

质谱

复杂的生物样品(如细胞裂解液)中蛋白质磷酸化的全面评估(磷酸化蛋白质组学)对于了解基于磷酸化的信号网络很重要。复杂的蛋白混合物中大规模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定，以及磷酸化残基的测序。质谱(MS)技术是完成这些任务的有用工具。