(1)饲养层的制备及分化抑制物的选择

常用的饲养层是由小鼠成纤维细胞无限系(STO)或小鼠原始胚胎成纤维细胞(PMEF)制备而成。STO或 PMEF经过丝裂霉素C等有丝分裂抑制剂处理后，与早期胚胎或PGC共同培养后，ES细胞就可以分离出来了。STO和PMEF细胞可以分泌成纤维细胞生长因子FGF、分化抑制因子LIF( leukminain hibitory factor)，这些因子有助于ES细胞增殖，而且能抑制细胞的凋亡和分化。此外，也可以用绵羊、山羊的输卵管或子宫上皮、牛的颗粒细胞、子宫成纤维细胞等作为分化抑制培养基。

(2)早期胚胎及PGC（原始生殖细胞）的培养和ES细胞的分离传代

将分离得到的早期胚胎或PGC置于饲养层或条件培养基上，在5%CO₂、37~39条件下进行培养。培养液一般为DMEM+15%胎牛血清(FCS)。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如分化抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、β2硫基乙醇( mercaptoe thanol)、非必需氨基酸、柠檬酸钠等。当胚胎内细胞团ICM增殖后或PGC出现ES样克隆后即可传代。ES细胞的增殖速度很快，小鼠ES细胞每7~8h倍增1次，猪类ES细胞每20h倍增1次，羊类ES细胞每40~50h倍增1次，牛类ES细胞每18~24h倍增1次。传代时一般是用胰酶EDTA消化，用吸管将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。

ES细胞可用DMEM+20S+20%DMSO(二甲基亚砜)作冷冻保护液，按每分钟1~3的速率降-35以下后，投入液氮中冷冻保存，37水浴解冻后可继续培养和传代。

不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同，在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。准确的分化诱导是应用干细胞治疗的基础，这需要对与干细胞发育有关的信号调节及微环境的影响进行详细研究。