QRT-PCR 方法

95℃预变性2min，然后进行以下循环；94℃变性15sec，55℃退火15sec，68℃延伸30sec，共进行45个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。

选择actinA为内参基因，每个样品做三个重复，用2^-△△Ct 法对样本基因进行表达差异相对定量分析。△△Ct=(C_{T target}–C_{T actinA}) _待测样本–(C_{T target}–C_{T actinA}) _校准样本 ，在本研究中我们选择每个基因在接种第一天中的表达为校准样本，第3、5、7天为待测样本。例如：

以1号样本为校准样本，2号为待测样本，应用△△Ct法进行分析：

第一步，应用参照基因对校准样本和待测样本进行校正：

△Ct_{（校准样本）} = Gene1（Mean Ct）₁－参照基因actinA （Mean Ct）₁

          =27.35－16.98

          =10.37

△Ct_{（待测样本）} = Gene1（Mean Ct）₂－参照基因actinA（Mean Ct）₂

          =27.52－16.86

          =10.66

第二步，校准样本和待测样本的△Ct 进行归一化：

△△Ct= △Ct_{（待测样本）}－△Ct_{（校准样本）} =10.66－10.37=0.29

第三步，表达差异计算：

2^-△△Ct = 2^－0.29 =  0.82

因此2号样本的Gene1的表达水平比一号低0.82倍。