荧光显微镜检测方法（以96孔板，A549贴壁细胞为例）

细胞培养

      取对数生长期细胞，以每孔4×10³~1×10⁵细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。

药物处理

   （可选）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。

EdU标记

    1.1  用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；

注：1）如果需配置10μM EdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；

    2）配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质，如LB培养基 4℃ 可稳定保存两周。

1.2  每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；

注：1）EdU培养基用量以没过细胞为宜(表1)；

2）最佳孵育时间与细胞周期相关（表2），大多数细胞系可采用2小时孵育时间；

3）EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育（<30min）宜采用高浓度（50 μM），长时间孵育（>24h）宜采用低浓度（1 μM），最佳孵育浓度需要优化。

1.3  PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。

注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。

细胞固定化

    2.1  每孔加入100μL 细胞固定液 (即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；

注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体染料进入细胞内。

2）可采用其他方式进行细胞固定。

2.2  每孔加入2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；

注：作用是中和多聚甲醛，当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤；

2.3  每孔加入100 μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；

2.4  （加强）每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。

注：当实验需要进行其他抗体染色，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。

Apollo染色

    3.1   每孔加入100 μL的1X Apollo®染色反应液（表3），避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

注：染色液用量与细胞培养体积相关，以覆盖细胞为宜（表1）。

3.2   加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂；

3.3   （加强）每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。

注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。

DNA染色

    4.1   用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存；

4.2   每孔加入100 μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；

4.3   每孔每次加入100 μL PBS清洗1~3次；

4.4   客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100 μL PBS保存待用。

 

其他染色(自备)

（可选）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色（注：染料兼容性请参照表4）。

图像获取及分析

    染色完成后，建议立即进行观测；如果条件限制，请避光 4℃ 湿润保存待测，但不应超过3天。

注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要>1s。

提示：预实验结果请发回锐博生物分析。

 

图1  多种细胞系EdU孵育2小时后检测细胞增殖

http://s15/middle/80ec9c84ga6beb46a331e&690

表5 细胞实验EdU孵育浓度及时间参考

PubMed ID	Reference	Cell line	Concentration	Time
18272492	Salic A. (2008) PNAS.	NIH3T3, Hela	10 nM to 10 μM	1 hr
18521918	Cappella P. (2008) Cytometry A.	HL-60, A2780, U2OS	1~10 μM	30 min
18996411	Chehrehasa F.(2009). J Neurosci Methods.	Neurospheres	1~20 μM	24 hr
19179371	Limsirichaikul S.(2009) Nucleic Acids Res.	Human primary fibroblasts	10 μM	0.5,1,2,4 hr
19253396	Warren M. (2009) Dev Dyn.	Chick embryos	10 μM to 2 mM	4 hr
19647746	Yu Y. (2009) J Immunol Methods.	Spleen cells	50 μM	24 hr
19544417	Momcilović O. (2010) Stem Cells.	Human ES cells	10 μM	30 min
20080700	Cinquin O. (2010) PNAS.	emb-30	1 μM	12 hr
20025889	Han W. (2010) Life Sci.	VSMC	50 μM	2 hr
20659708	Huang C. (2010) J Genet Genomics.	ESC	50 μM	2 hr
21310713	Hua H. (2011) Nucleic Acids Res.	fission yeast strains	10 μM	3 hr
20824490	Lv L. (2011) Mol Cell Biochem.	EJ cells	50 μM	4hr
21248284	Yang S. (2011) Biol Reprod.	GC cells	50 μM	2 hr
21227924	Zhang YW. (2011) Nucleic Acids Res.	U2OS, HT29	30 μM	90 min

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。

 

动物实验方法（以1cmＸ1cm切片为例）  

注：建议勿采用in vitro试剂盒做动物实验。

实验前须知

     EdU的分子量为252.23，易溶于水，PBS等缓冲液，生理盐水，更易溶于有机溶剂。

 EdU建议初始给药量为 5mg/kg，稀释浓度为0.5~1mg/mL。

 

表6  EdU溶解体积参考

EdU	0.1mg	1mg	2mg	10mg	50mg	500mg
溶剂	100μL	1mL	2mL	10mL	50mL	500mL

 

 

注：1）以上只是溶剂溶解体积，注射时可以进一步稀释，不会影响EdU的稳定性；

EdU标记

1.1  预实验：以小鼠为例，用200μL 生理盐水稀释0.1mg EdU后，腹腔注射，6小时后切片(小肠和目的组织)，染色（需要Hoechst复染），拍照观察。提示：预实验结果请发至锐博生物分析。

1.2  正式实验（具体参数可参考下列文献，表7）：

1）注射方式：依据客户实验而定，如腹腔注射、皮下注射，肌肉注射、尾静脉注射等方式，其中腹腔注射为多；

2）标记时间：最佳标记时间依据具体实验目的而定，小肠等增殖快的组织宜采用短时间标记(<2hr)，大脑等增殖慢的组织及器官宜采用长时间标记；

3）标记浓度：最佳标记浓度依据具体标记时间而定，一般来说，5mg/kg剂量适合大部分实验；

4）取样部位：依据客户实验目的而定，一次标记可以对多种组织和器官切片，由于小肠上皮组织增殖较快，可以作为标记参考。

 

表7  动物实验EdU标记时间及剂量参考 

PubMed ID	Reference	Species	Method	Amount	Time	Tissue
18272492	Salic, A. (2008) PNAS.	Mice	腹腔注射	100 μg	96hr	Brain
19554638	Kaiser CL. (2009) Laryngoscope.	Chicken	皮下注射	50mg/kg	72hr	Cochlear
19494148	Guo F. (2009) J Neurosci.	Mice	腹腔注射	100 μg/g body weight	3hr	Brain
19179611	Tibor Z. (2009) Am J Pathol.	Mice	腹腔注射	50mg/kg	3hr/20hr	-
20664699	Wiley LA. (2010) Mol Vis.	Mice	腹腔注射	100~200 μg	1hr	Eye
20163731	Schmidt EJ. (2010) BMC Dev Biol.	Mice	腹腔注射	200 μg	30min	embryo
20064490	Zeng C. (2010) Brain Res.	Mice	腹腔注射	50mg/kg	4hr~30d	Brain
20038597	Janas ML. (2010) J Exp Med.	Mice	腹腔注射	100 μg	4hr	Thymi
21145612	Sun H. (2011) J Hepatol.	Mice	腹腔注射	100 μg	72hr	-

 

 

 

 

 

 

 

 

注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。