EdU产品使用说明1_锐博生物

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EdU产品使用说明1

(2011-06-28 12:12:34)

标签：

胸腺嘧啶

细胞增殖

edu检测方法

实验参考

分类： EdU

产品简介

试剂盒应用EdU直接测定细胞内DNA的变化。EdU（5-Ethynyl -2’- deoxyuridine）是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子中，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面的研究，尤其适合进行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他药物的筛选实验。

与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似，而EdU染料只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等），可有效避免样品损伤，而且无需抗原抗体反应，能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。

试剂盒内容

试剂	浓度	*In vitro*			*In vivo*
试剂	浓度	C10310	C10327	C10313	C10321	C10322	C10314
EdU溶液 (试剂A)	1000X	20 μL	100 μL	200 μL	-	-	-
EdU溶剂 (试剂A)	粉末	-	-	-	2 mg	10 mg	50 mg
Apollo^®反应缓冲液 (试剂B)	20X	500 μL	2.5 mL	5 mL	500 μL	500 μL	500 μL
Apollo^®催化剂溶液 (试剂C)	100X	100 μL	500 μL	1 mL	100 μL	100 μL	100 μL
Apollo^®荧光染料溶液 (试剂D)	300X	30 μL	150 μL	300 μL	30 μL	30 μL	30 μL
Apollo^®缓冲添加剂 (试剂E)	粉末	100 mg	500 mg	1 g	100 mg	100 mg	100 mg
Hoechst 33342 (试剂F)	100X	150 μL	750 μL	1.5 mL	150 μL	150 μL	150 μL

运输与保存

室温运输，4˚C储存，勿冻存，荧光试剂请避光保存，可稳定储存一年。

使用前须知

贴壁细胞宜采用荧光检测方式，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测，亦可进行爬片检测，。

悬浮细胞可用涂片方式荧光检测，亦可采用流式细胞仪分析，但流式细胞仪需要具备相应荧光通道(表4)。

实验准备

• PBS (pH 7.2~7.6)

• 渗透剂(含0.5% Triton X-100的PBS)

• 甘氨酸溶液(2 mg/mL)（去离子水配置）
• 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)

• 96/24/12/6孔培养板

注意：请使用一次性手套，废液请妥善处理。

实验参考

表1 EdU培养基及染色反应液的使用量参考

	96孔板*	48孔板	24孔板	12孔板	6孔板	5 cm 小皿
EdU培养基	100 μl	150 μl	200 μl	300 μl	500 μl	2 mL
染色反应液	100 μl	150 μl	200 μl	300 μl	500 μl	2 mL

注：1）*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜；2）悬浮细胞EdU用量请按培养体积而定。

表2 EdU孵育时间取决于细胞生长速度

			3T3	Hela	HEK293*
细胞系	人胚胎细胞	酵母细胞	人成纤维细胞	人宫颈癌细胞	人胚肾细胞系	人神经细胞
细胞周期	~30min	~3h	~18h	~21h	～25h	~5d
孵育时间	5min	20min	2h	2h	2h	1d

注： 1）EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5；

2）*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，细胞周期会有所变化，但大多数细胞系可采用2h孵育时间。

表3 Apollo^®染色反应液的配置（现用现配）

配制顺序	Apollo^®染色反应液	500μL*	1 mL	5 mL	10 mL
1	去离子水	469 μL	938 μL	4.69 mL	9.38 mL
2	Apollo^®反应缓冲液 (试剂B)	25 μL	50 μL	250 μL	500 μL
3	Apollo^®催化剂溶液 (试剂C)	5 μL	10 μL	50 μL	100 μL
4	Apollo^®荧光染料溶液 (试剂D)	1.5 μL	3 μL	15 μL	30 μL
5	Apollo^®缓冲添加剂 (试剂E)	5 mg	9 mg	44 mg	88 mg

注：1）*表示通常配制的Apollo®反应液的体积；

2）按顺序配制适量1X Apollo®染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)；

3）试剂E 为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换。

粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过±20%。

表4 配套染料的相关波长信息

产品编号	荧光染料	Excitation	Emission	Similar to
C00031	Apollo^® 567	550 nm	565 nm	Cy3
C00041	Apollo^® 643	653 nm	667 nm	Cy5
C00033	Hoechst 33342	350 nm	461 nm	DAPI

注：1）荧光显微镜宜采用Hoechst 33342 和 Apollo® 567进行检测DNA复制活性；

2）激光共聚焦显微镜采用Apollo® 567或Apollo® 643均可。

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