农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：20103202
	受控号：3
	版号：6
阪崎肠杆菌	页码：共9页  第 1页

 

引用方法：GB 4789.40—2010

1 范围  本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）的检验方法。

本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。 

2 设备和材料 

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 

2.1  恒温培养箱： 

25 ℃±1℃，36 ℃±1℃，44 ℃±0.5℃。 

2.2  冰箱：2 ℃～5 ℃。 

2.3  恒温水浴箱： 

44 ℃±0.5℃。 

2.4  天平：感量 

0.1 g。 

2.5 均质器。 

2.6 振荡器。 

2.7 无菌吸管： 1 mL（具 0.01 mL刻度）、10 mL（具 0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 

2.8 无菌锥形瓶：容量 100 mL、200 mL、2000 mL。 

2.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 2.10 pH或 pH比色管或精密 pH试纸。 

2.11 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂 

3.1 缓冲蛋白胨水（ buffer peptone water，BPW）：见附录 A中 A.1。 

3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 

-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin 

medium，mLST-Vm）：见附录 A中 A.2。 

3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。 

3.4 胰蛋白胨大豆琼脂（ trypticase soy agar，TSA）：见附录 A中 A.3。 

3.5 生化鉴定试剂盒。 

3.6 氧化酶试剂：见附录 A中 A.4。 

3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录 A中 A.3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录 A中 A.6。 

3.9 L-精氨酸双水解酶培养基：见附录 A中 A.7。 

3.10糖类发酵培养基：见附录 A中 A.8。 

3.11西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A中 A.9。

第一法阪崎肠杆菌的检验 

4 检验程序  阪崎肠杆菌检验程序见图 1。 

检样 100 g（mL）  +BPW稀释液 900 mL 

36 ℃±1℃，18 h±2 h

1 mL + mLST-Vm 10 mL

 

 

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挑取疑似菌落

TSA44 ℃±0.5℃，24 h±2 h

阪崎肠杆菌显色培养基 

36 ℃±1 ℃，24 h±2 h 

25 ℃±1 ℃，48 h±4 h 

挑取黄色菌落生化鉴定

5 操作步骤 

5.1 前增菌和增菌 

取检样 100 g（mL）加入已预热至 44℃装有 900 mL缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至

充分溶解，36 ℃±1 ℃培养 18 h±2 h。移取 1 mL转种于 10 mL mLST-Vm肉汤， 44 ℃±0.5 ℃培养 24 h±2 

h。 

5.2 分离 

5.2.1 轻轻混匀 mLST-Vm肉汤培养物，各取增菌培养物 1环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色 

培养基平板，36 ℃±1℃培养 24 h±2 h。 

5.2.2 挑取 1个～5个可疑菌落，划线接种于 TSA平板。25 ℃±1 ℃培养 48 h±4 h。 

5.3 鉴定

自 TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表 1。可选

择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

表1 阪崎肠杆菌的主要生化特征 

生化试验特征

黄色素产生＋

氧化酶－

L-赖氨酸脱羧酶－

L-鸟氨酸脱羧酶（＋） 

L-精氨酸双水解酶＋

柠檬酸水解（＋） 

发酵

D-山梨醇（－） 

L-鼠李糖＋ 

D-蔗糖＋ 

D-蜜二糖＋

苦杏仁甙＋

 

 

 

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注：＋＞99%阳性；－＞99%阴性；（＋）90%－99%阳性；（－）90%－99%阴性。 

6 结果与报告 

综合菌落形态和生化特征，报告每 100 g（mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。

第二法阪崎肠杆菌的计数 

7 操作步骤 

7.1 样品的稀释 

7.1.1 固体和半固体样品：无菌称取样品 100 g、10 g、1 g各三份，加入已预热至 44℃分别盛有 900 mL、 

90 mL、9 mL BPW中，轻轻振摇使充分溶解，制成 1:10样品匀液，置 36 ℃±1 ℃培养 18 h±2 h。分别

移取 1 mL转种于 10 mL mLST-Vm肉汤， 44 ℃±0.5℃培养 24 h±2 h。 

7.1.2 液体样品：以无菌吸管分别取样品 100 mL、10 mL、1 mL各三份，加入已预热至 44℃分别盛

有 900 mL、90 mL、9 mL BPW中，轻轻振摇使充分混匀，制成 1:10样品匀液，置 36 ℃±1 ℃培养 18h±2h。

分别移取 1 mL转种于 10 mL mLST-Vm肉汤，44 ℃±0.5 ℃培养 24 h±2 h。 

7.2 分离、鉴定 

同 5.2，5.3。 

8 结果与报告 

综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查 

MPN检索表，报告每 

100 g（mL）

样品中阪崎肠杆菌的 

MPN值（见附录Ｂ中表 

B.1）。 

附录A 

（规范性附录） 

培养基和试剂 

A.1缓冲蛋白胨水（BPW） 

A.1.1成分

蛋白胨 10.0g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 9.0 g

磷酸二氢钾 1.5 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 7.2 

A.1.2制法

加热搅拌至溶解,调节 

pH，121 ℃高压灭菌 

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15 min。 

A.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin 

medium，mLST-Vm） 

A.2.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤 

A.2.1.1成分

氯化钠 34.0 g

胰蛋白胨 20.0 g

乳糖 5.0 g

磷酸二氢钾 2.75 g

磷酸氢二钾 2.75 g 

十二烷基硫酸钠 0.1 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 6.8±0.2 

A.2.1.2制法

加热搅拌至溶解，调节 

pH。分装每管 

10 mL，121 ℃高压灭菌 

15 min。 

A.2.2万古霉素溶液 

A.2.2.1成分

万古霉素 10.0 mg

蒸馏水 10.0 mL 

A.2.2.2制法 

10.0 mg万古霉素溶解于 

10.0 mL蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在 

0 ℃～5 ℃保存 

15天。 

A.2.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin 

medium，mLST-Vm）

每 

10 mL mLST加入万古霉素溶液 

0.1 mL，混合液中万古霉素的终浓度为 

10 μg/ mL。

注：mLST-Vm必须在 

24 h之内使用。 

A.3胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） 

A.3.1成分

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胰蛋白胨 15.0 g

植物蛋白胨 

5.0 g

氯化钠 5.0 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 7.3±0.2 

A.3.2 

制法

加热搅拌至溶解，煮沸 

1 min，调节 

pH，121 ℃高压 

15 min。 

A.4 

氧化酶试剂 

A.4.1 

成分 

N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0 g

蒸馏水 100 mL 

A.4.2 

制法

少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在 

7 d之内使用。 

A.4.3 

试验方法

用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在 

10 s之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。

注：实验中切勿使用镍/铬材料。 

A.5 

L-赖氨酸脱羧酶培养基 

A.5.1 

成分 

L-赖氨酸盐酸盐（L-lysine monohydrochloride） 

5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL 

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pH 6.8±0.2 

A.5.2 

制法

将各成分加热溶解，必要时调节 

pH。每管分装 

5 mL，121 ℃高压 

15 min。 

A.5.3实验方法

挑取培养物接种于 

L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。 

30 ℃±1℃培养 

24 h±2 h，

观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。 

A.6L-鸟氨酸脱羧酶培养基 

A.6.1 

成分 

L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithine monohydrochloride） 

5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 6.8±0.2 

A.6.2 

制法

将各成分加热溶解，必要时调节 

pH。每管分装 

5 mL。121 ℃高压 

15 min。

A.6.3实验方法

挑取培养物接种于 

L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。 

30 ℃±1℃培养 

24 h±2 h，

观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。 

A.7L-精氨酸双水解酶培养基 

A.7.1成分 

L-精氨酸盐酸盐（L-arginine monohydrochloride） 5.0 g

酵母浸膏 3.0 g

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葡萄糖 1.0 g

溴甲酚紫 0.015 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 6.8±0.2 

A.7.2制法

将各成分加热溶解，必要时调节 

pH。每管分装 

5 mL。121 ℃高压 

15 min。 

A.7.3实验方法

挑取培养物接种于 

L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。 

30 ℃±1℃培养 

24 h±2 h，

观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。 

A.8糖类发酵培养基 

A.8.1基础培养基 

A.8.1.1成分

酪蛋白（酶消化） 10.0 g

氯化钠 5.0 g

酚红 0.02 g

蒸馏水 1 000 mL 

pH 6.8±0.2 

A.8.1.2制法

将各成分加热溶解，必要时调节 

pH。每管分装 

5 mL。121 ℃高压 

15 min。 

A.8.2糖类溶液（ 

D-山梨醇、 

L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙） 

A.8.2.1成分

糖 8.0 g

蒸馏水 100 mL 

A.8.2.2制法

分别称取 

D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各 

8 g，溶于 

100 mL蒸

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馏水中，过滤除菌，制成 

80 mg/mL的糖类溶液。 

A.8.3完全培养基 

A.8.3.1成分

基础培养基 875 mL

糖类溶液 125 mL 

A.8.3.2制法

无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管 

10 mL。 

A.8.4实验方法

挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30 ℃±1 ℃培养 

24 h±2 h，

观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。

A.9西蒙氏柠檬酸盐培养基 

A.9.1成分

柠檬酸钠

氯化钠

磷酸氢二钾

磷酸二氢铵

硫酸镁

溴百里香酚蓝

琼脂

蒸馏水 

2.0 g 

5.0 g 

1.0 g 

1.0 g 

0.2 g 

0.08 g 

8.0 g～18.0 g 

1 000 mL 

pH 6.8±0.2 

A.9.2制法

将各成分加热溶解，必要时调节 

pH。每管分装 

10 mL，121 ℃高压 

15 min，制成斜面。 

A.9.3 

实验方法

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挑取培养物接种于整个培养基斜面，36 ℃±1 ℃培养 

24 h±2 h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。

附录 B （规范性附录） 

阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表 

B.1 阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表 

每 100 g（mL）检样中阪崎肠杆菌最可能数（MPN）的检索见表 B.1。

表 B.1 阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表

阳性管数

MPN 

95%可信限阳性管数

MPN 

95%可信限 

100 10 1 下限上限 100 10 1 下限上限 

0 0 0 ＜0.3 -0.95 

2 2 0 2.1 0.45 4.2 

0 0 1 0.3 0.015 0.96 2 2 1 2.8 0.87 9.4 

0 1 0 0.3 0.015 1.1 2 2 2 3.5 0.87 9.4 

0 1 1 0.61 0.12 1.8 2 3 0 2.9 0.87 9.4 

0 2 0 0.62 0.12 1.8 2 3 1 3.6 0.87 9.4 

0 3 0 0.94 0.36 3.8 3 0 0 2.3 0.46 9.4 

1 0 0 0.36 0.017 1.8 3 0 1 3.8 0.87 11 

1 0 1 0.72 0.13 1.8 3 0 2 6.4 1.7 18 

1 0 2 1.1 0.36 3.8 3 1 0 4.3 0.9 18 

1 1 0 0.74 0.13 2 3 1 1 7.5 1.7 20 

1 1 1 1.1 0.36 3.8 3 1 2 12 3.7 42 

1 2 0 1.1 0.36 4.2 3 1 3 16 4 42 

1 2 1 1.5 0.45 4.2 3 2 0 9.3 1.8 42 

1 3 0 1.6 0.45 4.2 3 2 1 15 3.7 42 

2 0 0 0.92 0.14 3.8 3 2 2 21 4 43 

2 0 1 1.4 0.36 4.2 3 2 3 29 9 100 

2 0 2 2 0.45 4.2 3 3 0 24 4.2 100 

2 1 0 1.5 0.37 4.2 3 3 1 46 9 200 

2 1 1 2 0.45 4.2 3 3 2 110 18 410 

2 1 2 2.7 0.87 9.4 3 3 3 ＞110 42 --

注 1：本表采用 3个检样量[100 g(mL)、10 g(mL)和 1 g(mL)]，每个检样量接种 3管。

注 2：表内所列检样量如改用 1 000 g(mL)、10 g(mL)、和 1 g(mL)时，表内数字应相应降低 10倍；如改用 10 g(mL)、1 g(mL)、和 0.1 g(mL) 时，则表内数字应相应增高 10倍，其余类推。