农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第1页

1 范围

本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的检验方法。

本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。

2 设备和材料

除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。

2.2 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃。

2.3 均质器。

2.4 显微镜：10×～100×。

2.5 电子天平：感量0.1 g 。

2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。

2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）。

2.8 无菌平皿：直径90 mm。

2.9 无菌试管：16 mm×160 mm.。

2.10 离心管：30 mm×100 mm。

2.11 无菌注射器：1 mL。

2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。

2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。

2.14 小白鼠：16 g～18 g。

2.15 全自动微生物生化鉴定系统。

3 培养基和试剂

3.1 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A 中A.1。

3.2 含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A 中A.2。

3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A 中A.3。

3.4 1 %盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A 中A.3.2.1。

3.5 1 %萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A 中A.3.2.1。

3.6 PALCAM 琼脂：见附录A 中A.4。

3.7 革兰氏染液：见附录A 中A.5。

3.8 SIM 动力培养基：见附录A 中A.6。

3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P 试验用]：见附录A 中A.7。

3.10 5 %～8 %羊血琼脂：见附录A 中A.8。

3.11 糖发酵管：见附录A 中A.9。

3.12 过氧化氢酶试验：见附录A 中A.10。

3.13 李斯特氏菌显色培养基。

3.14 生化鉴定试剂盒。

4. 检验程序

单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图1。

图1 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序

5 操作步骤

5.1 增菌

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第2页

以无菌操作取样品25 g（mL）加入到含有225 mL LB1 增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续

均质1 min～2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均质杯中，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2

min。于30 ℃±1 ℃培养24 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，于30 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。

5.2 分离

取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36 ℃±1 ℃培养

24 h～48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，

周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明

进行判定。

5.3 初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36

℃±1 ℃培养24 h；同时在TSA-YE 平板上划线纯化，于30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。选择木糖阴性、鼠

李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

30 ℃±1 ℃，18 h～24 h

30 ℃±1 ℃，24 h

检样

25 g(mL)样品+LB1 增菌液225 mL，均质

0.1 mL+10 mL LB2 增菌液

36 ℃±1 ℃，24 h～48 h

李斯特氏菌显色培养基PALCAM 琼脂

接种木糖、鼠李糖，36 ℃±1 ℃，24 h；同时于

TSA-YE 平板划线纯化，30 ℃±1 ℃，24 h～48 h

木糖－，鼠李糖＋

5.4 鉴定

5.4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；

用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

5.4.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。

5.4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续

进行糖发酵试验和MR-VP 试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。

 

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第3页

5.4.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20 个～25 个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血

平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺

克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36 ℃±1 ℃培养24 h～48

h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李

斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。

5.4.5 协同溶血试验 (cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌， 挑取纯

培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30 ℃±1 ℃培养24

h～48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血

也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。

5.5 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等对5.3 中3 个～5 个纯培养的可疑菌落进行

鉴定。

表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别

菌种 溶血反应 葡萄糖 麦芽糖 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷

单核细胞增生李斯特氏菌

(L. monocytogenes)

＋ ＋ ＋ ＋/＋ － ＋ － ＋

格氏李斯特氏菌

(L. grayi)

－ ＋ ＋ ＋/＋ ＋ － － ＋

斯氏李斯特氏菌

(L. seeligeri)

＋ ＋ ＋ ＋/＋ － － ＋ ＋

威氏李斯特氏菌

(L. welshimeri)

－ ＋ ＋ ＋/＋ － V ＋ ＋

伊氏李斯特氏菌

(L. ivanovii)

＋ ＋ ＋ ＋/＋ － － ＋ ＋

英诺克李斯特氏菌

(L. innocua)

－ ＋ ＋ ＋/＋ － V － ＋

注：＋阳性；－阴性；V 反应不定。

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 4页

5.6 小鼠毒力试验（可选择）

将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE 中，于30 ℃±1 ℃培养24 h，4 000 r/min 离心5 min，

弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL 的菌悬液，取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3 只～

5 只，每只0.5 mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2 d～5 d 内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细

胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。

6 结果与报告

综合以上生化试验和溶血试验结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)

A.1.1 成分

胰胨 17.0 g

多价胨 3.0 g

酵母膏 6.0 g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钾 2.5 g

葡萄糖 2.5 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.1.2 制法

将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)

A.2.1 成分

胰胨 17.0 g

多价胨 3.0 g

酵母膏 6.0 g

氯化钠 5.0 g

磷酸氢二钾 2.5 g

葡萄糖 2.5 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.2.2 制法

将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.3 李氏增菌肉汤(LB1，LB2)

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第5页

A.3.1 成分

胰胨 5.0 g

多价胨 5.0 g

酵母膏 5.0 g

氯化钠 20.0 g

磷酸二氢钾 1.4 g

磷酸氢二钠 12.0 g

七叶苷 1.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.3.2 制法

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.3.2.1 李氏Ⅰ液 (LB1)225 mL 中加入：

1 % 萘啶酮酸 (用0.05 mol/L 氢氧化钠溶液配制) 0.5 mL

1 % 吖啶黄 (用无菌蒸馏水配制) 0.3 mL

A.3.2.2 李氏Ⅱ液 (LB2)200 mL 中加入：

1 % 萘啶酮酸 0.4 mL

1 % 吖啶黄 0.5 mL

A.4 PALCAM

A.4.1 成分

酵母膏 8.0 g

葡萄糖 0.5 g

七叶甙 0.8 g

柠檬酸铁铵 0.5 g

甘露醇 10.0 g

酚红 0.1 g

氯化锂 15.0 g

酪蛋白胰酶消化物 10.0 g

心胰酶消化物 3.0 g

玉米淀粉 1.0 g

肉胃酶消化物 5.0 g

氯化钠 5.0 g

琼脂 15.0 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2～7.4

A.4.2 制法

将上述成分加热溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.4.2.1 PALCAM 选择性添加剂

多粘菌素B 5.0 mg

盐酸吖啶黄 2.5 mg

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 6页

头孢他啶 10.0 mg

无菌蒸馏水 500 mL

A.4.2.2 制法

将PALCAM 基础培养基溶化后冷却到50 ℃，加入2 mL PALCAM 选择性添加剂，混匀后倾倒在无

菌的平皿中，备用。

A.5 革兰氏染色液

A.5.1 结晶紫染色液

A.5.1.1 成分

结晶紫 1.0 g

95％乙醇 20.0 mL

1％草酸铵水溶液 80.0 mL

A.5.1.2 制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.5.2 革兰氏碘液

A.5.2.1 成分

碘 1.0 g

碘化钾 2.0 g

蒸馏水 300 mL

A.5.2.2 制法

将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。

A.5.3 沙黄复染液

A.5.3.1 成分

沙黄 0.25 g

95％乙醇 10.0 mL

蒸馏水 90.0 mL

A.5.3.2 制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.5.4 染色法

A.5.4.1 将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。

A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。

A.5.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。

A.6 SIM 动力培养基

A.6.1 成分

胰胨 20.0 g            多价胨 6.0 g

硫酸铁铵 0.2 g   硫代硫酸钠 0.2 

 

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第7页

琼脂 3.5 g

蒸馏水 1 000 mL

pH 7.2

A.6.2 制法

将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.6.3 试验方法

挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30 ℃培养24 h～48 h，观察结果。

A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR 和VP 试验用)

A.7.1 成分

多胨 7.0 g   葡萄糖 5.0 g   磷酸氢二钾 5.0 g    蒸馏水 1 000 mL

pH 7.0

A.7.2 制法

溶化后调节pH，分装试管，每管1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.7.3 甲基红（MR）试验   A.7.3.1 甲基红试剂   A.7.3.1.1 成分

甲基红 10 mg

95 %乙醇 30 mL

蒸馏水 20 mL

A.7.3.1.2 制法

10 mg 甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL 蒸馏水。

A.7.3.1.3 试验方法

取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结

果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。

A.7.4 V-P 试验

A.7.4.1 6 % α-萘酚-乙醇溶液

成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。

A.7.4.2 40 %氢氧化钾溶液

成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。

A.7.4.3 试验方法

取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL 和

40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴

性，应放在36 ℃±1 ℃继续培养4 h 再进行观察。

A.8 血琼脂

 

 

 

 

农业部农产品质量监督检验测试中心(北京)	文件编号：
	受控号：
	版号：
李斯特氏菌	页码： 共8页 第8页

A.8.1 成分

蛋白胨 1.0 g

牛肉膏 0.3 g

氯化钠 0.5 g

琼脂 1.5 g

蒸馏水 100 mL

脱纤维羊血 5 mL～10 mL

A.8.2 制法

除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 ℃高压灭菌15 min，冷到50 ℃，以无菌操作加

入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。

A.9 糖发酵管

A.9.1 成分

牛肉膏 5.0 g

蛋白胨 10.0 g

氯化钠 3.0 g

磷酸氢二钠(Na2HPO4⋅12H2O) 2.0 g

0.2 %溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL

蒸馏水 1 000 mL

A.9.2 制法

A.9.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5 %加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内，

调节pH 至7.4，115 ℃高压灭菌15 min，备用。

A.9.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL，115 ℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL 糖溶液加入于100 mL 培养基内，以无菌操作分装

小试管。

A.9.3 试验方法

取适量纯培养物接种于糖发酵管，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳

性。

A.10 过氧化氢酶试验

A.10.1 试剂

3%过氧化氢溶液：临用时配制。

A.10.2 试验方法

用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内，,滴加3 %过氧化氢溶液2 mL，观察

结果。

A.10.3 结果

于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。