一、目的要求

　　1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

　　2．巩固显微镜的使用方法。

　　二、基本原理

　　所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

　　在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐（methylenebluechloride，缩写为MBC），它可被电离成正、负离子：

MBC→methylene blue++chloride-

　　带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

　　细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

　　三、器材

　　显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶，擦镜纸，生理盐水；

　　吕氏碱性美蓝染色液，石炭酸复红染色液；

　　金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌。

　　四、操作步骤

　　1．涂片取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作（图Ⅳ-1，具体操作参照实验一），分别挑取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

　　2．干燥于室温中自然干燥。

　　3．固定涂片面向上，于火焰上通过2—3次，使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

　　4．染色放标本于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。吕氏碱性美蓝染色液约染2—3分钟，石炭酸复红染色液约染1—2分钟。

　　5．水洗染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后才可置油镜下观察。

　　6．镜检

　　按实验二操作程序进行显微镜观察。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　绘出你所观察到的经单染色的两种细菌形态图。

　　2．思考题

　　（1）根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？

　　        （2）制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？

吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液

　　A液：美蓝(methylene blue) 0． 6g

　　95%酒精 30ml

　　B液：KOH 0．01g

　　蒸馏水 100ml

　　分别配制A液和B液，配好后混合即可。

齐氏(Ziehl)石炭酸复红染色液

　　A液：碱性复红(basic fuchsin) 0．3g

　　95%酒精 10ml

　　B液：石炭酸 5．0g

　　蒸馏水 95ml

　　将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，配成A液。

　　将石炭酸溶解于水中，配成B液。

　　混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5—10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。