鞭毛染色法及活细菌运动性的观察

　　一、目的要求

　　1．学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。

　　2．学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。

　　二、基本原理

　　鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0．01—0．02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。

　　在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。

　　三、器材

　　苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），假单胞菌（Pseudomonas sp．），金黄色葡萄球菌；

　　鞭毛染色液，万分之一的美蓝水溶液，凡士林，无菌水，载玻片，凹玻片，盖玻片等。

　　四、操作步骤

　　1．鞭毛染色

方法一

　　(1)菌种用新培养的菌种为宜，如所用菌种已长期未移种，则用新制备的斜面连续移种2—3次后再使用。最好是将经活化的菌种接种到新制备的琼脂斜面或半固体培养基平皿上，培养10小时左右，备用。鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是 生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。

　　(2)制片 在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，注意不要挑上培养基，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。

　　(3)染色 涂片干燥后滴加A液染3—5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30—60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。

　　(4)镜检 镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。

　　细菌鞭毛染色要求非常小心细致，染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c)新鲜的染色液；(d)载玻片要求干净无油污。鞭毛染色所用载玻片的清洗方法如下：

　　选择光滑无伤痕的玻片。先用洗衣粉煮沸，洗衣粉最好在洗玻片前加蒸馏水煮沸，用滤纸过滤去渣。为了避免玻片彼此磨损，最好把载玻片放在特制的架上煮，煮毕稍冷却后取出，用清水洗净，再放入浓洗液中浸泡24小时左右，取出用清水冲洗残酸，最后用蒸馏水洗净，沥干水并放于95％乙醇中脱水，取出玻片，用火焰烧去酒精，立即使用。如不立刻使用，可存放于干净的盒中或50％乙醇中短期存放。由于空气中常常漂浮油污，最好立即使用。在洗净的玻片上滴上水滴后应能均匀散开。

方法二 鞭毛染色(改良Ryu法)    

   1．玻片的处理：要求用新的载玻片。用前须在95％酒精中浸泡24小时以上。用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。

   2．在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制2个涂片。

   3．用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。

    4．玻片置室温自然干燥。

    5．滴加染液于玻片上，染色。

    6．约10～15min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。

    7．玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。

　　2．运动性观察

　　(1)压滴法

　　(a)分别将5ml无菌水倒入苏云金芽孢杆菌、假单胞菌和金黄色葡萄球菌的斜面培养物内，制成菌悬液。各取出1ml菌液稀释至肉眼看不到混浊为止。

　　(b)各取2—3环三种稀释菌液，分别放在三片清洁的载玻片中央，再各放一环万分之一的美蓝水溶液混匀。

　　(c)用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。按此法分别将盖玻片覆盖于三种菌液上。

　　(d)先以低倍镜找到标本，再用高倍镜观察，观察时光线要调得暗些。

　　(2)悬滴法

　　(a)在洁净盖玻片周围涂少许凡士林。

　　(b)在盖玻片中央滴一小滴菌液，或用接种环取1—2环菌液置于中央。

　　(c)将凹玻片反转，使凹窝中心对准盖玻片上的菌液滴，液滴不得与凹玻片接触，以接种环柄轻压使盖玻片与凹玻片粘在一起，液滴处于封闭的小室中，防止液滴干燥和气流的影响。

　　(d)小心将凹玻片翻转过来，使菌滴仍悬浮在盖玻片下和凹窝中心（图Ⅳ-3）。

　　(e)先用低倍镜找到悬滴边缘，再用高倍镜观察。观察时光线要调得暗一些。

　　用悬滴法分别观察苏云金芽孢杆菌、假单胞菌和金黄色葡萄球菌的运动性。细菌的运动有一定的前进方向，并可转弯，极生单鞭毛菌类多为直线运动，周生鞭毛菌类多作波浪式运动。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　你观察到的三种菌是否都有鞭毛？绘图表示你所观察到的细菌鞭毛着生情况。

　　2．思考题

　　(1)你所观察到的三种菌是否都具运动性？为什么？

　　(2)没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。

鞭毛染色液（方法一）

　　A液：单宁酸 5g

　　FeCl₃ 1．5g

　　蒸馏水 100ml

　　福尔马林(15%) 2．0ml

　　NaOH(1%) 1．0ml

　　配好后，当日使用，次日效果差，第三日则不宜使用。

　　B液：AgNO₃ 2g

　　蒸馏水 100ml

　　待AgNO₃溶解后，取出10ml备用，向其余的90mlAgNO₃中滴入浓NH₄ON，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH₄OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mlAgNO₃慢慢滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO₃，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈雾不重，此染剂可使用一周，如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。

鞭毛染色液（方法二）

A液：    5％石炭酸            10ml

                         鞣酸                   2g

饱和硫酸铝钾液    10ml

B液：  结晶紫酒精饱和液

    应用液：A液10份，B液1份，混合，室温存放。