金线莲多糖抗化学性肝损伤及其作用机制的研究_人在远方

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金线莲多糖抗化学性肝损伤及其作用机制的研究

(2024-11-19 08:06:19)

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365

金线莲多糖抗化学性肝损伤及其作用机制的研究

吴岩斌

福建农林大学

摘要：

金线莲是兰科开唇兰属（金线兰属）植物花叶开唇兰（金线兰）Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.的新鲜或干燥全草,是福建特色食药两用物质。多糖是金线莲的主要活性成分,具有抗氧化、保肝、降血糖、免疫调节、抗类风湿关节炎和减肥等多种生物活性。

研究证实,金线莲粗多糖（ARP）对四氯化碳（CCl4）诱导的肝损伤小鼠具有明显的保护作用,然而金线莲中具有肝保护作用的多糖的结构特征及其潜在作用机制尚不清楚。本研究建立了金线莲多糖部分酸水解后的特征寡糖图谱,同时对金线莲中多糖进行系统的分离纯化和结构表征。进一步研究了金线莲主要多糖ARP-1a对CCl4诱导的急性肝损伤小鼠的肝保护作用,并采用16S rRNA测序、代谢组学、脂质组学、转录组学等技术阐明ARP-1a保肝作用的潜在机制。

主要研究内容和结果如下:

（1）采用亲水作用色谱/超高效液相色谱-高分辨质谱（HILIC/UHPLC-HRMS）法建立金线莲及其混伪品多糖部分酸水解的特征寡糖图谱,结合主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）筛选出差异寡糖标志物。PCA和OPLS-DA结果显示,金线莲和其他同属混伪品可以较好地分开,表明金线莲多糖部分酸水解的HILIC/UHPLC-HRMS特征寡糖图谱能够用于鉴别金线莲与混伪品。

（2）采用水提醇沉法从金线莲中提取总多糖,进一步结合DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephacryl S-200凝胶柱色谱从金线莲中分离纯化得到4个新的均一多糖ARP-1a、ARP-1b、ARP-2a和ARP-2b。通过HPGPC、HPLC、GCMS、FT-IR和NMR等技术对多糖结构进行表征,4个均一多糖的相对分子质量Mw分别为1.47×10～4Da、5.96×10～3 Da、5.46×10～4 Da、1.68×10～4 Da,均由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,但其摩尔比不同。甲基化和核磁共振分析表明,ARP-1a、ARP-1b、ARP-2a主链由→4)-galp-（1→和→4）-glcp-（1→组成,末端残基位于→4）-Glcp-（1→的O-6上,具有相同的侧链。而ARP-2b主链由→4）-galp-（1→、→6）-glcp-（1→和→4）-glcp-(1→组成,末端残基Manp-（1→连接在→4）-Glcp-(1→的O-6位上。研究结果丰富了金线莲多糖结构的多样性。

（3）以CCl4诱导的肝损伤小鼠为模型,评价金线莲主要均一多糖ARP-1a的保肝作用。结果显示,ARP-1a能显著降低CCl4致肝损伤小鼠血清中AST、ALT、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,降低肝组织MDA含量,提高肝组织抗氧化酶SOD、CAT活力和GSH水平。H&E染色结果显示,ARP-1a能明显改善CCl4诱导急性肝损伤小鼠的肝脏病理损伤,明显减少肝细胞坏死,减轻炎性细胞浸润。Western blot结果显示,ARP-1a可以上调肝损伤小鼠肝组织Nrf2、HO-1、GCLC蛋白的表达,提示ARP-1a抗肝损伤作用可能与激活Nrf2通路有关。

（4）采用16S rRNA测序技术分析金线莲均一多糖ARP-1a对CCl4致肝损伤小鼠肠道菌群组成的影响,以GC-MS技术检测各组小鼠盲肠内容物中短链脂肪酸的含量。Alpha多样性分析和Beta多样性分析结果表明,ARP-1a能提高CCl4致肝损伤小鼠肠道菌群的多样性,能改变其肠道菌群组成。与正常对照组（NC组）相比,模型组（MC组）Muribaculaceae属细菌的相对丰度显著增加。与MC组相比,ARP-1a高剂量组（ARP-1a H组）Muribaculaceae属细菌的相对丰度降低,但差异不显著。此外,与NC组相比,MC组Bacteroides和Alistipes属细菌的相对丰度无显著变化。与MC组相比,ARP-1a H组Bacteroides和Alistipes属细菌的相对丰度显著增加。与NC组相比,MC组的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量显著降低,ARP-1a H组乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量显著高于MC组。相关性分析结果显示,乙酸、丁酸、戊酸的含量与Bacteroides属细菌的丰度表现出显著的正相关性,而乙酸和丁酸的含量与Odoribacter属细菌的丰度呈显著正相关。结果表明,ARP-1a抗肝损伤作用可能与其调节肠道菌群结构,增加短链脂肪酸含量有关。

（5）UHPLC-Q Exactive HF-X检测肝组织代谢产物的变化情况,以PCA和OPLS-DA分析筛选肝组织样品差异代谢物,通过KEGG通路富集分析相关代谢通路。代谢组学分析结果显示,ARP-1a H组vs MC组筛选到23种差异代谢物,主要涉及甘油磷脂代谢、逆行内源性大麻素信号、α-亚麻酸代谢、等代谢途径,其中甘油磷脂代谢是关联性最显著的代谢途径。脂质组学分析结果显示,ARP-1a H组vs MC组筛选到84种差异脂质代谢物,这些差异脂质代谢物主要参与脂肪的消化和吸收、脂肪细胞脂解的调节、产热、NF-κB信号通路等途径。研究结果表明,ARP-1a可通过调节肝脏脂质代谢紊乱,进而发挥抗肝损伤的作用。

（6）采用RNA-seq技术分析NC组、MC组和ARP-1a H组的差异表达基因,GO和KEGG pathway富集分析各组差异表达基因。结果显示,ARP-1a组vs MC组差异基因有1021个,富集于1282个生物学过程、125个细胞组分314个分子功能;KEGG pathway富集分析提示,ARP-1a组vs MC组差异基因富集于胰腺分泌（Pancreatic secretion）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、蛋白质消化和吸收（Protein digestion and absorption）、视黄醇代谢（Retinol metabolism）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）等信号通路。对转录组学和脂质代谢组学结果进行联合分析,发现肝脏差异表达基因和差异脂质代谢物共同显著富集于胰腺分泌、MAPK信号通路、脂肪消化吸收、胰岛素抵抗、产热作用等5种途径。进一步通过Western blot技术对MAPK信号通路中关键的主要信号通路进行验证,结果显示ARP-1a能显著降低p38MAPK、ERK1/2、JNK的磷酸化水平,抑制MAPK信号通路的激活,该结果进一步阐明了ARP-1a抗肝损伤的分子机制。

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