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(2024-11-19 08:11:39)
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金线莲水溶性多糖的结构及其免疫活性研究
张政
南昌大学
摘要：
金线莲(Anoectochilus
roxburghii)是兰科开唇兰属多年生草本植物,素有“金草”和“神药”等美称,被列为《中国野生保护植物清单》中的二级保护植物。金线莲枝叶貌美,富含多种功能成分,如生物碱、黄酮类、糖苷、蛋白质和多糖等,不仅可用于观赏,也被应用于食品、医药等领域。金线莲不仅具有保肝护肝、降血压、降血脂等作用,还具有增强免疫力和抗氧化等功效。
多糖是金线莲的主要生物活性成分之一,本文以金线莲多糖为研究对象,采用水提醇沉法、分级醇沉法和阴离子交换树脂脱色法对金线莲多糖进行提取和分离纯化。在综合应用现代仪器分析技术测试金线莲多糖的化学结构和溶液性质的基础上,构建免疫抑制动物模型,探讨金线莲多糖对免疫低下小鼠肠道健康的影响,为金线莲资源的开发与利用提供理论依据。
主要研究内容和结果如下:
(1)采用热水浸提、乙醇醇沉、有机试剂洗涤和透析的方式从金线莲中制备得到金线莲多糖ARP,进一步采用分级醇沉的方式对ARP进行分级纯化,获得了40%乙醇醇沉组分ARPP-40和70%乙醇醇沉组分ARPP-70。采用高效凝胶渗透色谱分析ARP组成,结果显示其中含有两种组分,相对重均分子量分别为457
kDa和12.4 kDa,而ARPP-40和ARPP-70的相对重均分子量的测试结果分别为423 kDa和10.8
kDa,与前述对ARP测试结果吻合。单糖组成和红外谱图分析结果表明,ARP和ARPP-70含有7种单糖,分别为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖和木糖,而ARPP-40中只含有葡萄糖。
(2)采用甲基化处理方法结合GC-MS检测技术,分析ARPP-40的糖苷键组成。进一步采用一维和二维核磁技术对ARPP-40中主要糖残基的化学位移进行归属研究,以获得ARPP-40的一级结构信息。结果表明,ARPP-40是中性α-葡聚糖,其主链由→4)-α-Glcp-(1→组成,端基葡萄糖通过O-6连接于主链之上,ARPP-40可能的一级结构如下:
(3)采用阴离子交换树脂对ARPP-70粗品加以纯化,获得了均一性良好的组分ARPP-70a。应用HPLC、FT-IR、GC-MS和NMR等仪器分析技术对ARPP-70a的一级结构进行解析,结果表明,ARPP-70a含有葡萄糖和半乳糖两种单糖,占比为23.9:76.1。ARPP-70a作为葡半乳聚糖,存在α和β两种构型,以→4)-β-Galp-(1→和→4)-α-Glcp-(1→为主链,端基半乳糖和葡萄糖通过O-2、O-3和O-6连接在主链之上。这是首次在金线莲水溶性多糖中分离纯化出具有葡半乳聚糖结构的多糖组分。ARPP-70a可能的重复结构单元为:
(4)采用尺寸排阻色谱-多检测器联用系统(HPSEC-MALLS)研究金线莲多糖ARPP-40和ARPP-70a的溶液构象。该系统对ARPP-40和ARPP-70a的回收率分别为103.7%和96.2%,因此所获得的数据可以代表两种多糖本身的构象特征。两者在0.1
mol/LNaNO3溶液中的分布较窄,具有较好的均一性和单分散度,测得的多分散指数(PDI)分别为1.02和1.04。ARPP-40和ARPP-70a的Mark-Houwink方程指数α分别为0.6210和0.5203,构象参数vh分别为0.5398和0.5059,表明他们在0.1
mol/LNaNO3溶液中均为无规线团链构象,且ARPP-40的刚性略大于ARPP-70a。应用扫描电镜,对ARPP-40和ARPP-70a的固体表观形貌进行分析,观察到其固体表面均为带孔球状。考察ARPP-40和ARPP-70a对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力以及总还原力,证实ARPP-40和ARPP-70a均具有一定的抗氧化能力,且ARPP-70a强于ARPP-40,可能与他们的结构差异有关。
(5)构建环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型,以研究金线莲多糖ARPP-40和ARPP-70a对小鼠肠道黏膜损伤和肠道免疫的影响。两者均能显著改善肠道粘膜的形态结构,使绒毛长度、隐窝深度和杯状细胞数量明显增加,因此可有效增强肠道上皮的屏障防御能力,具有缓解和修复肠道粘膜损伤的功效。ARPP-40和ARPP-70a也能显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数、细胞因子的分泌水平,起到增强小鼠免疫能力的作用。
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