平衡透析法的原理是用具有一定截留分子量的透析袋将小分子从混合溶液中分离出来，而大分子则保留在透析袋中，当透析达到平衡时，膜两侧溶液中小分子的浓度相同，通过测定小分子浓度即可分析得到大分子与小分子结合的数据。透析的动力是扩散压，扩散压是由跨膜两边的小分子的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。

小分子与蛋白质相互作用的研究主要集中在小分子与蛋白质结合强度、结合方式、结合位点、结合距离以及能量转移效率等方面。平衡透析法有着操作简单、温度易于控制、pH值可调和设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化和被测物质易降解等缺点。而且仅利用平衡透析法不能说明小分子与蛋白质之间的具体结合部位、相互作用后蛋白质的结构变化及相互作用时的能量变化等问题，因此还需要结合光谱技术和热力学分析等方法，才能获得更准确的作用信息。

  在分析小分子与蛋白质相互作用中，平衡透析法可以与紫外光谱、荧光光谱、微量热法、高效液相色谱、质谱和毛细管电泳等方法连用。在蛋白质分子中某些氨基酸残基和许多小分子中都有生色团，在紫外光谱中能产生吸收峰，根据峰形和峰位的变化即可判定小分子是否与蛋白质发生作用。利用荧光光谱研究蛋白质的荧光猝灭过程就能得到小分子与蛋白质作用的结合常数、作用区域及位置等信息。平衡透析法通过与等温滴定量热或差示扫描量热法连用，可以获得热力学和动力学信息。通过平衡透析法与多种技术的综合运用，多个参数同时表征作用过程，多种试验手段对比分析，会对小分子与蛋白质结合的数据分析得更加准确且具有说服力。