目的 验证在远距预处理中抑制线粒体钙单向转运体对缺血、再灌注心肌的保护作用的假设。

    方法 结扎冠脉左前降支使心脏局部缺血30min，然后再灌注120min形成缺血/再灌注损伤模型。分别应用远距离预处理、线粒体钙单向转运体抑制剂、线粒体钙单向转运体激动剂进行干预。远距预处理采用右股动脉结扎5min，再灌注5min，反复3个循环实现。再灌注过程中测量平均动脉压，心率，血浆乳酸脱氢酶水平，结束后测量心肌梗死面积。

    结果 与缺血/再灌注组相比，远距预处理再使灌注后心肌梗死面积缩小[ (20.4±2.5) ％比(51.0±6.0)％]，乳酸脱氢酶的释放减少［(271±9)U/L比（339±39）U/L］；而在远距预处理前给予精胺或SB202190干预后，则梗死面积、乳酸脱氢酶降幅均减小,分别为 [ (40.8±9.2) ％， (383±43)U/L；(44.3±6.8) ％， (356±26)U/L］。

    结论 远距预处理通过抑制线粒体钙单向转运体的开放可以减轻缺血/再灌注对缺血心肌的损伤，起到对缺血心肌的保护作用。

   

    缺血及再灌注（I/R）是心脑血管疾病及治疗过程中常见的病理改变。远距离预处理则是种通过短暂的远离靶器官的远端组织的缺血起到靶器官保护作用的技术。1993年Przyklenk^[1]等发现，对左旋支施行预处理可明显增强前降支所支配区域心肌的抗缺血性损伤的能力。远距预处理通过短暂的远端其他器官的缺血，比如小肠、肾脏，肢体^[2-5]，同样可以起到心脏保护作用。

    钙超载在缺血再灌注损伤中起了关键作用。在心脏搏动过程中，通过一高度选择性的钙离子通道——线粒体钙单向转运体，细胞质中大量的钙离子内流至线粒体内^[6]。既往研究已证实缺血预处理可以抑制线粒体钙单向转运体的开放，但是远距离预处理中是否同样是通过该机制起到心肌保护作用仍然未知。

    本文将研究通过下肢缺血实现的远距预处理是否有心脏保护作用以及验证线粒体钙单向转运体是否参与该保护机制。

   

1  材料和方法

1.1 材料及动物分组

   雄性SD大鼠36只（浙江医学科学院实验动物中心提供），体重230g~260g，所有实验流程均得到中国浙江杭州的浙江大学伦理委员会关于实验动物使用的审查。线粒体钙单向转运体抑制剂（钌红），线粒体钙单向转运体激动剂（精胺，SB202190），2, 3, 5-氯化三苯四唑（2, 3, 5-triphenyl-tetrazolium chloride ，TTC)以及埃文斯蓝均购自sigma公司。

    所有大鼠均经过心肌局部缺血（结扎前降支）30min和复灌120min的过程。远距预处理则是在前降支结扎前实施，右股动脉闭塞5min，再灌注5min，如此反复3个循环^[8]。给药复灌注组在复灌注开始前5min开始给药，持续5min。大鼠随机分组到下列6组（6只/组）：

    （1）缺血/再灌注（Ischemia reperfusion ，I/R）组：大鼠前降支停灌30 min复灌120min作为缺血／再灌注损伤模型；

    （2）远距预处理（Remote  preconditioning ， remote PC）组：大鼠股动脉停灌5min，复灌5min，三个循环作为远距预处理，其余同缺血/再灌注组；

    （3）钌红复灌组：在冠脉复灌起始前5分钟经股静脉缓慢静注线粒体钙单向转运体抑制剂钌红5min (2.5mg/kg)，余同缺血/再灌注组；

    （4）精胺复灌组：在冠脉复灌起始前5分钟经股静脉缓慢静注线粒体钙单向转运体激动剂精胺5分钟（5mg/kg），余同缺血/再灌注组；

    （5）精胺＋远距离预处理组：精胺（5mg/kg）在远距预处理前10min静脉给药，余同远距预处理组；

    （6）SB202190＋远距预处理组：SB202190（5mg/kg）在远距预处理前10min静脉给药，余同远距预处理组。

    在检测LDH时增加正常对照组

 

1.2 手术操作

        大鼠在水合氯醛（0.4g/kg,腹腔内注射）麻醉后，再以水合氯醛（0.016g/kg）间断腹腔注射维持深度麻醉。气管切开，气管插管，连接啮鼠动物的呼吸机。所有大鼠予以呼吸机通气，高浓度氧，70次/min，潮气量为1.0ml/100mg 体重。通过调节速率及潮气量维持正常血气酸碱度状态，调节加热垫使之恒温于37℃。左颈动脉插管测血压、心率，通过压力传感器连接于数据采集系统（中国南京医学实验室）。左股静脉插管用于给药和/或补液。

        通过左第4或5肋肋间行胸廓切开术，暴露心脏。以5-0号缝合线在冠状动脉前降支起始部下2～3mm处横穿，末端套入聚四氟乙烯管，收紧线两端，心外膜上出现紫绀，血压下降，提示结扎冠状动脉成功，若放松线，心外膜能充血，则提示恢复灌注。游离右后肢股动脉，以一缝合线横穿其下方备用，通过应用动脉止血钳来实现动脉闭塞及再灌注。

 

1.3 心肌梗死面积的测定

    在120min复灌结束后，分离出心脏，接上Langendorff装置洗去血液。用丝线将左冠状动脉前降支再次结扎，以1％的埃文斯蓝经主动脉灌注染色，非梗死区则不染色。冰冻（-20℃）2～3h后沿与心长轴垂直方向将心脏横切成2～3 mm厚的切片，切片在37℃时用1％的TTC（ PH 7.4）浸染10～15min，区分梗死区（白）与非梗死区（红），经图像扫描后用Image/J图像分析软件（NIH）测量梗死区和非梗死区的面积。梗死心肌面积百分比（％）=梗死区/损伤区×100％。

    5.血浆乳酸脱氢酶水平的测定：血浆乳酸脱氢酶（LDH）的浓度以分光光度进行测量。本实验选取复灌10分钟后的血浆，已往实验证实此时的血浆LDH达到高峰^[8]。

    6.统计学处理：实验结果以`X±S表示，用SPSS16.0 软件分析，统计学显著差异以单向方差分析Newman-Keuls法分析，P<0.01有显著性差异。

   

2  结果

2.1 血流动力学参数

    各组平均动脉压和心率在30min冠脉闭塞后均下降，120min再灌注后有不同程度的上升，但差异无统计学意义（表1）。

    表1  各组血流动力学参数(`X±S)

    30 min

    60 min

    120 min

平均动脉压(mmHg)

缺血/再灌注+ 钌红组

缺血/再灌注+ 精胺组

远距预处理组+精胺组

远距预处理+SB202190

心率 (beats/min)

缺血/再灌注+ 钌红组

缺血/再灌注+ 精胺组

远距预处理组+精胺组

远距预处理+SB202190

a与基线比较aP <0.05, b与基线比较bP <0.01.