目的　探讨益母草水苏碱干预NE诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用。

    方法　采用改良Simpson 法培养乳鼠心肌细胞，选用NE 诱导制作心肌细胞肥大模型，随机分为对照组，NE（10^-6M）组，Sta高中低剂量（10^-4M、10^-5M、10^-6M）组及Car（10^-6M）组。在药物作用的1d、3d、5d和7d后收集细胞，采用图像分析系统测量心肌细胞表面积，BCA法检测细胞蛋白含量，荧光微量测定细胞DNA含量，ELISA法检测细胞ANP和BNP含量，以细胞表面积、Protein/DNA比值以及ANP和BNP含量作为检测指标，观察益母草水苏碱对肥大心肌细胞的药效学作用。

    结果　NE在刺激细胞3d后，与对照组比较可显著增大心肌细胞表面积及Protein/DNA的比值（P＜0.05），成功制备出心肌细胞肥大模型。益母草水苏碱作用于细胞1d后，Sta大中小剂量组与NE组比较，各项指标没有统计学差异（P＞0.05）。益母草水苏碱作用于细胞3d后，Sta大中剂量组与NE组比较可以明显降低细胞的表面积、Protein/DNA的比值及ANP含量（P＜0.05），各组BNP含量没有统计学差异（P＞0.05）；Sta小剂量组较NE组降低了细胞表面积（P＜0.05），其它各项指标没有差异（P＞0.05）。益母草水苏碱作用于细胞5d后，Sta大中小剂量组较NE组显著降低细胞的表面积、Protein/DNA的比值及ANP含量（P＜0.05），各组BNP含量与NE组比较，有降低的趋势，但是没有统计学差异（P＞0.05）。益母草水苏碱作用于细胞7d后，Sta大中小剂量组与NE组比较，明显降低细胞的表面积、Protein/DNA的比值、ANP和BNP含量（P＜0.05）。

    结论　益母草水苏碱具有抗NE诱导乳鼠心肌细胞肥大作用。

   

    早期心脏对于过高负荷的主要代偿性反应表现为心肌肥大，初期可以维持机体的需要，但长时间所致的持续性心肌肥大最终会因心脏功能失代偿导致心力衰竭和猝死。心肌肥大是导致心力衰竭的关键性的始动环节，及早干预心肌肥大的发生，是延缓/逆转心力衰竭的关键环节。本实验室在前期的整体实验中发现，益母草生物碱对皮下注射异丙肾上腺素造成的大鼠心肌损伤具有保护作用，能够提高冠状动脉结扎大鼠心肌收缩舒张功能，改善大鼠急性心肌梗死后的心功能，并且能够提高心衰模型大鼠心肌肌浆网上的钙泵（SERCA2a）活性以及含量。但对心肌肥大的影响尚未有报道。本课题就是在前期工作基础上选用益母草水苏碱作用于由NE诱导的肥大心肌细胞，在细胞水平深入探索治疗心肌肥大、预防其发展为心力衰竭的新思路和新方法。

 

    盐酸水苏碱(Stachydrine Hydrochloride,Sta,中国药品生物制品检定所）；卡维地洛(Carvedilol,Car,德国曼海姆Roche Diagnostics GmbH生产)；DMEM/F12(奥地利PAA公司)；胎牛血清(奥地利PAA公司)；马血清(奥地利PAA公司) ；胰蛋白酶（1:250,美国Sigma公司）；Ⅱ型胶原酶（327u/mg,美国Worthington公司）；去甲肾上腺素（NE, 美国Sigma公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，碧云天生物技术研究所）；小牛胸腺DNA（10μg/ml,美国Sigma公司）；Hoechst33258(美国Sigma公司)；ANP ELISA试剂盒（美国R&B公司）；BNP ELISA试剂盒（美国R&B公司）

    pH仪(PB-10 Sartorius Germany)；制冷离心机(ZENTRIFUGEN， Germany)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；恒温振荡水槽 (上海精宏实验设备有限公司)；CO₂培养箱(Heraeus ,Germany)；CKX41倒置相差显微镜(Olympus，Japan)；超声破碎机(SONICS， U.S.A)；酶标仪（ELX800，Bio-tek，U.S.A）；荧光分光光度计（HITACHI F-4500，Japan）；MIAS医学图像分析管理系统

    1～2日龄的Wistar大鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第02-22-2号。

 

    对Simpson方法加以改进，新生1～2d的乳鼠皮肤消毒后，取心脏，用缓冲液冲洗后，去心房，将心室剪成1mm³的组织块，加入消化液（0.1%胰蛋白酶，0.04%胶原酶Ⅱ），置37⁰C振荡水浴中消化10min，七至八次，将上清收集到含15%血清（10%马血清和5%胎牛血清）的D/F12培养基的离心管中终止消化，并以1000rpm，5min离心，弃上清。离心后加入预热到37⁰C的含血清培养基，差速贴壁90min，调整细胞密度为5×10⁵cell/ml，加入Brdu(终浓度为0.1mM），将细胞接种于24孔板，含血清培养基培养48h后，换为无血清培养基。

    实验随机分为6组，每组4孔，分别为对照组、NE (10^-6M) 组、NE＋Sta(10^-4M)组、NE＋Sta(10^-5M)组、NE＋Sta(10^-6M)组和NE＋Car(10^-6M)组，37℃，5%CO₂中培养。以后每48h换液加药一次。分别在药物干预的1d、3d、5d和7d后拍照，收集渗出液及细胞待测。

2.3.1　心肌细胞表面积测定

    分别在细胞培养的第1d、3d、5d和第7d时，将培养板至于倒差显微镜下，随机选取5个视野拍照，然后用MIAS医学图像分析管理系统测量心肌细胞面积。

2.3.2　心肌细胞Protein/DNA比值测定

2.3.2.1　BCA法测细胞蛋白含量   

细胞收集，超声破碎，按照BCA试剂盒说明在酶标仪波长为570nm处测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

2.3.2.2　荧光微量检测细胞DNA含量

    细胞收集，超声破碎，样品1：9与Hoechst33258工作液混匀，小牛胸腺DNA为标准品，荧光分光光度计（激发波长356nm，发射波长492nm）测定，根据标准曲线和样品的荧光强度可以直接得出样品DNA的含量。

2.3.3　心肌细胞ANP含量测定

    收集细胞，超声破碎，按照ANP试剂盒说明在酶标仪波长为450nm处测定OD值，根据样品的OD值在标准曲线上计算其浓度。

2.3.4　心肌细胞BNP含量测定

    收集细胞培养上清，按照BNP试剂盒说明在酶标仪波长为450nm处测定OD值，根据样品的OD值在标准曲线上计算其浓度。

    各组实验数据以平均值±标准差（ ± s）表示，采取GraphPad Prism5统计软件，采用单因素方差分析组间两两比较。

 

    结果显示，NE作用于心肌细胞1d后，细胞表面积没有太大变化（P＞0.05）。NE作用于心肌细胞3d、5d和7d后，三个时间点都能明显增加心肌细胞表面积（P＜0.05）。水苏碱的三个剂量组和卡维地洛组能够在第3d、5d和7d三个时间点上，不同程度的降低NE诱导的肥大心肌细胞表面积（P＜0.05）。

    表1　各组细胞表面积的变化（http://www.365heart.com/upload/newsimg/20091123132543168.gif ± s, n＝4）

Group	Culture Time(d)
	1            3             5              7
Control	93.11±3.76	105.69±6.48	106.63±8.58	109.54±5.44
NE(10-6M)	107.85±7.33	149.25±9.51*	172.34±12.9*	184.17±15.84*
NE＋Sta(10-4M)	100.25±2.54	102.78±2.89#	115.55±6.68#	119.12±8.04#
NE＋Sta(10-5M)	105.22±5.93	114.42±4.02#	121.28±6.76#	128.69±6.48#
NE＋Sta(10-6M)	108.98±5.11	120.90±4.71#	134.98±4.75#	135.82±5.49#
NE＋Car(10-6M)	106.82±5.27	121.18±5.87#	124.94±4.55#	132.82±6.29#

注：与对照组比较*P＜0.05；与NE组比较^# P＜0.05

   

    Protein/DNA比值即心肌细胞蛋白浓度/心肌细胞DNA浓度，以对照组作以标准化。结果显示，第1d时，NE组与对照组没有明显变化（P＞0.05）。第3d，5d和第7d时NE组Protein/DNA比值与对照组相比，显著增加（P＜0.05），水苏碱三个剂量组和卡维地洛组与NE组相比较Protein/DNA比值降低（P＜0.05），但未呈现剂量依赖性。第3d时，水苏碱小剂量组与NE组比较比值有降低趋势，但差异没有统计学意义（P＞0.05）。

    表2　各组细胞Protein与DNA比值的变化（ ± s, n＝4）

Group	Culture Time(d)
	1             3             5             7
Control	1	1	1	1
NE(10-6M)	1.31±0.24	1.51±0.28*	1.54±0.04*	1.94±0.10*
NE＋Sta(10-4M)	1.19±0.21	1.23±0.08#	1.18±0.09#	1.16±0.02#
NE＋Sta(10-5M)	1.25±0.23	1.27±0.10#	1.28±0.24#	1.23±0.04#
NE＋Sta(10-6M)	1.28±0.12	1.38±0.22	1.34±0.03#	1.25±0.08#
NE＋Car(10-6M)	1.16±0.06	1.24±0.16#	1.29±0.01#	1.21±0.07#

注：与对照组比较*P＜0.05；与NE组比较^# P＜0.05

    http://www.365heart.com/upload/newsimg/20091123132553829.gif

    测定细胞各组匀浆中ANP含量的变化，结果显示，第1d时，NE组ANP 含量与对照组无显著差异（P＞0.05）。第3d、5d和7d时NE组ANP含量与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），水苏碱大中小三个剂量组和卡维地洛组与NE组比较都降低了ANP含量（P＜0.05），水苏碱小剂量组在第3d时ANP有降低的趋势，但没有统计学差异（P＞0.05）。

    表3　各组细胞匀浆中ANP的变化（ ± s, n＝3）

Group	Culture Time(d)
	1             3           5           7
Control	4.82±2.18	11.76±2.62	10.46±3.62	20.80±2.93
NE(10-6M)	7.28±4.10	18.04±1.24*	29.48±4.69*	38.55±6.35*
NE＋Sta(10-4M)	5.85±0.87	12.05±2.62#	7.85±1.39#	15.54±1.01#
NE＋Sta(10-5M)	5.69±3.19	6.69±0.43#	7.57±3.06#	15.11±4.19#
NE＋Sta(10-6M)	8.00±5.42	16.27±0.62#	12.49±2.55#	19.56±5.90#
NE＋Car(10-6M)	4.53±1.56	10.17±0.61#	5.97±1.52#	18.68±5.27#

注：与对照组比较*P＜0.05；与NE组比较^# P＜0.05

    测定各组细胞培养上清液中BNP含量的变化，结果显示，第1d、3d、5d时，NE组BNP 含量有增长趋势，但与对照组比较无显著差异（P＞0.05），用药各组较NE组有所改善，但没有统计学差异（P＞0.05）；第7d时NE组BNP含量较对照组增大，有统计学差异（P＜0.05），水苏碱各组和卡维地洛组较NE组都不同程度降低了BNP含量（P＜0.05）。

表4  各组细胞培养上清液中BNP的变化（ ± s, n＝3）

Group	Culture Time(d)
	1            3            5              7
Control	30.73±2.57	36.32±2.41	41.95±1.48	52.92±1.68
NE(10-6M)	32.68±0.78	48.29±7.22	47.03±4.56	84.59±8.85*
NE＋Sta(10-4M)	31.78±2.39	33.60±5.14	39.85±8.17	49.21±6.69#
NE＋Sta(10-5M)	29.68±3.78	37.39±4.38	45.64±1.92	50.43±3.30#
NE＋Sta(10-6M)	32.24±3.70	40.15±8.34	38.93±7.37	63.48±8.16#
NE＋Car(10-6M)	31.64±4.98	44.73±4.85	48.50±4.92	69.22±9.64#

注：与对照组比较*P＜0.05；与NE组比较^# P＜0.05

 

    心肌细胞为终末分化细胞，不具有像其他细胞受到刺激后而出现的细胞增殖能力，取而代之的细胞只能以增加体积和蛋白含量的机制来适应负荷的增加。故可以从心肌细胞体积、表面积、蛋白合成速率和总含量这几方面来作为衡量心肌细胞肥大的指标。细胞表面积可以直接采用图像分析的方法，而蛋白的测定方法较多，

    目前测细胞蛋白合成常用的方法一是采用同位素标记氨基酸掺入法能较敏感的反应蛋白质合成速率的改变，但存在易污染环境；需特殊检测仪器；另一方面实际上心肌细胞肥大时蛋白质的分解代谢也可能同时发生改变，因此，蛋白质合成速率不能反应心肌细胞蛋白质合成与分解代谢的最终效应。方法二是测蛋白总含量，方法较多且简便易行，但实际上不能保证每一样本的细胞数量是相等的，不能客观反映单个细胞的肥大反应。一般认为心肌细胞无再生能力，也就意味心肌细胞其数目并没有增加，细胞DNA含量也应恒定，因此，准确测定单个心肌细胞蛋白含量，是客观直接反映心肌细胞肥大的关键指标。目前Hoechst33258荧光微量测定细胞DNA方法成熟灵敏且简便易行。本实验采用Protein/DNA比值法计算单个细胞蛋白含量，客观科学地来判断心肌细胞肥大。

    作为交感神经递质的NE具有诱导心肌细胞肥大的作用己被很多研究证实。故本实验选择复制NE诱导的乳鼠心肌细胞肥大模型。实验结果表明NE可使心肌细胞表面积增加，而对心肌细胞DNA合成及细胞数目无影响，可直接诱导心肌细胞肥大的发生而不依赖于血流动力学因素。

    既往研究表明益母草及其单体对心肌缺血、心肌梗死、缺血再灌注等有改善和保护作用。但在心肌肥大方面还未有文献报道。本课题在复制NE诱导心肌细胞肥大模型基础上，选择益母草水苏碱的大中小三个剂量作用于细胞，实验结果显示，益母草水苏碱随着作用于细胞时间的延长，可以降低肥大心肌细胞表面积和Protein/DNA比值，说明可以抑制心肌细胞的肥大反应。

    心肌肥大时，ANP和BNP二者在心肌细胞表现为代偿性增加，已被公认为心肌肥大过程伴随的特征性变化指标。在心衰代偿期，心室肌细胞亦可合成和分泌ANP，且ANP的分泌量随着心衰的恶化而增高。BNP是心衰时一种重要的神经内分泌因子，主要由心室肌细胞合成和分泌。BNP合成后并不储存于细胞内而是直接释放并进入血液循环。近年来的研究发现心力衰竭患者血浆ANP和BNP水平高于正常人。虽然心衰时血浆ANP的变化与BNP有许多相似之处，但并不对等，心衰代偿期和失代偿期心肌ANP含量均增高，而BNP仅在心衰失代偿期分泌增加。我们在实验过程中，对于ANP和BNP分别从两种样本形式中进行了检测，发现使用细胞培养上清液来测定ANP含量时，OD读数很小，组与组之间的差异甚微，不能进行统计学分析，表明ANP没有分泌到细胞外，培养上清液中的含量极少，实验结果与文献报道相一致；使用细胞匀浆测定BNP含量时，OD读数很小接近于0点，组与组之间的差异甚微，不能进行统计学分析，表明BNP合成后在细胞内不能储存，立即释放到细胞外，实验结果与文献报道相一致。实验结果显示益母草水苏碱可以不同程度的降低肥大心肌细胞ANP和BNP的含量，抑制心肌细胞的肥大反应。