制备Aβ 单体和寡聚体

    为了检验特定的Aβ种类在诱导神经细胞周期事件中的作用，我们使用纯化了的合成物Aβ。Aβ寡聚体的制备是通过在NaCl中解聚Aβ肽，在不同的时间点于PBS中“老化” Aβ，并且最终通过SEC分馏法纯化Aβ单体和Aβ寡聚体 （Fig 1A and 1B）。由这种实验方法得到了一致的，同类的Aβ单体和寡聚体峰；随着孵化时间延长，Aβ单体的比例增加 （Fig 1A）。在不形成原细纤维/原纤维的情况下，3h孵化时间产生的单体Aβ和寡聚体Aβ相对浓度（峰值）一致。在这些实验条件下产生的SEC分馏物将在接下去的实验中使用。

    Western Blot证实了单体Aβ和寡聚体Aβ在SEC分馏物中的存在。与之前的发现一致[26-28]，Aβ单克隆抗体6E10检验出在单体的制品中含有4.5 kDa的Aβ活性单体，而在寡聚体的制品中不仅含有Aβ单体，还含有分子量更高的Aβ（Fig 1B）。对分子量不同的Aβ种类在SEC分馏物中所占比例的量化，证实了Aβ单体的分馏中含有100％Aβ单体，而Aβ寡聚体的分馏中含了26％Aβ单体，24％Aβ二聚体，20％Aβ三聚体，18％Aβ四聚体和12％有着更高分子量的（>20 kDa）Aβ寡聚体。

Aβ寡聚体诱导神经元细胞周期事件

   为了检验由SEC纯化的Aβ单体和Aβ寡聚体是否能够诱导神经元细胞周期事件，我们将21 DIV原代脑皮质神经元暴露在不同浓度（0.2－0.4 μg/ml）的SEC分馏物中24h（加入了BrdU）。我们之所以选择21 DIV来做这些实验，是因为大多数神经元在这个阶段是成熟和分化完全的。然而，我们持续发现大约5－10％的MAP2阳性神经元在21 DIV培养中呈现出基本水平的BrdU合成（Fig 2M-O Veh）。这些结果与之前在小鼠[29，30]和大鼠脑皮质神经元5－10DIV[31]中的发现是一致的。目前，这个基础的BrdU合成是否是因为一小部分神经元干细胞的继续分裂，还是因为少数非神经元细胞的去分化，目前还不清楚。

    考虑到Aβ种类的构型可能在上述处理模式中改变，我们首先通过Western blot检验了组织培养基在被Aβ单体和寡聚体处理前后Aβ分子的大小。抗体6E10对Aβ的检测表明，在所有被检验的浓度范围内，和开始点（Fig. 1C-0h）相比，在24h的时间点，单体和寡聚体Aβ种类的移动性都看不出有什么变化（Fig. 1C-24h）。这些结果表明，Aβ单体和多聚体在暴露阶段是相对稳定的。

    Aβ单体和寡聚体对神经元细胞周期事件的作用效果是由对MAP2和BrdU的双重免疫荧光染色来决定的。这些研究显示，和空白载体处理的神经元（Fig. 2A-C）相比，在Aβ寡聚体（Fig. 2G-I）但非Aβ单体（Fig. 2D-F）处理的神经元中，核内BrdU合成有所增加。对这些结果的量化表明，和空白载体处理组（Fig. 2M-O-Veh）中BrdU合成的基础水平（13±6％）相比，在Aβ寡聚体处理组（Fig. 2N）中BrdU合成有2－5倍的增加。BrdU合成的增加与神经元暴露在Aβ寡聚体的浓度有关。当寡聚体的浓度达到2.0－4.0 μg/ml时，从统计学来看，BrdU的合成显著增加（Fig. 2N）。相反，和空白载体处理组对比，经SEC纯化后的Aβ单体在任何实验浓度下都不能改变BrdU阳性神经元的总数（Fig. 2D-F和2M）。有趣的是，目前的研究中Aβ寡聚体的浓度范围对BrdU合成的作用与之前报的对突触毒性的作用相似[15]。

    为了检验Aβ寡聚体对神经元细胞周期事件的作用是否是因为浓度非常低、在生化检测范围之外的Aβ原纤维污染了纯化的寡聚体制剂，我们同样制备了Aβ原纤维[32]，并用它处理21 DIV原代脑皮质神经元。将神经元暴露在浓度为4.0 μg/ml 的Aβ原纤维中，这一浓度的Aβ低聚体曾显著诱导了神经元细胞周期事件。然而和Aβ寡聚体不同，Aβ原纤维不能在统计学上对诱导BrdU合成有显著的改变（Fig. 2J-L和2O）。此外，根据以前的报道－Aβ原纤维在更高浓度下可诱导细胞周期事件[30]，我们也检验了更高浓度Aβ原纤维（20 μg/ml）的作用。用更高浓度的Aβ原纤维处理神经元，结果是，BrdU合成有增加的趋势，但没有达到统计学的显著性差异（Fig. 2O）。我们的实验结果和早期的报道一致，那就是大约4.0 μg/ml的Aβ_25－35原纤维不能诱导BrdU阳性神经元的数量[29]，而约40 μg/ml的Aβ_1－42原纤维可使神经元细胞BrdU合成百分数提高到原来的2倍[30]。总之，这些结果证明Aβ寡聚体是比Aβ单体或Aβ原纤维更强的神经元细胞周期事件诱导剂。

    为了证明Aβ寡聚体的处理可以诱导异常的神经元细胞周期事件，不同情况下处理所得的细胞裂解产物被用来检验PCNA（细胞周期S期标记）。与BrdU合成的实验结果一致，增加的Aβ寡聚体浓度可使从脑皮质神经元获得的可溶性细胞裂解产物中的PCNA水平正向升高（Fig. 2P）。在神经元暴露在不同浓度的Aβ寡聚体之后，Western blot对PCNA的表达进行了量化，并由相对应的GAPDH水平相对比，这一结果揭示了PCNA与浓度正相关的增加（Fig. 2Q），当Aβ寡聚体的浓度达到最高时，有统计上的显著性（空白载体：41.82 ± 2.9 VS Aβ寡聚体：105 ± 5.0 for 20 μg/ml, p = 0.008）。相反的，用Aβ单体处理，没有呈现出类似PCNA水平的增加（数据未显示）。总之，这些结果证明了纯化的稳定的Aβ寡聚体制剂可以诱导原代脑皮质神经元的细胞周期事件，这是和Aβ寡聚体的浓度正相关的；而在Aβ单体和Aβ原纤维的处理中没有发现类似的现象。