于定国是于公的儿子，他自幼随父学习治狱，在郡县基层负责狱讼多年，深得其父治狱心得，德行甚高。因此，于定国升迁很快，很快迁御史中丞。昭帝死后，二十七天闹剧的昌邑王的罪行也是于定国最先揭发，宣帝即位后，于定国升为光禄大夫，“平尚书事”，参与国家大事，后又迁为廷尉，负责全国狱讼事项。

定国始终坚持以德治狱，为人谦恭，在执法过程中，特别注重对弱势群体的照顾，凡是遇到这种事件，都倍加谨慎。一时间朝中流传一句话：“张释之为廷尉，天下无冤民；于定国为廷尉，民自以不冤”。张释之是文景时期一位刚正不阿的法官，在他的治理下出现了“天下无冤民”的景象。但于定国较之更甚，他用德行教化民众，使得大家各司其职，各安其业，让民众自己内心不滋扰生事，不产生诉讼，更不觉得欺枉。于定国在廷尉的职位上，一待便是十八年。后迁为御史大夫。

御史大夫是二副，仅次于丞相，更是最佳的丞相候选人。大汉的丞相多数都曾在御史大夫这一职位上任职。御史大夫主管检察之事，宣帝甘露年间代黄霸为丞相，封西平侯。元帝即位后，于定国与御史大夫陈万年并位八年，一时间“万方之事，大录于君”，凭借着自己常年的政治经验，“常率丞相议可”。但经过了有凤来仪的宣帝繁荣期，到元帝时，虽然国力依然强盛，但各种矛盾也开始凸显了，灾害不断，流民乱窜，这让朝堂每天都绷着一根神经。在古时有一套成熟的消灾法则，加上天人感应在汉末的烂熟，帝王门更相信这是自己包括丞相等臣工们在其位不谋其政，面临着元帝的频频问责，于定国惶恐不得终日。但他也无计可施，多种救灾方式同时开展，但也未能挽救帝国的颓象。在元帝的挽留下，于定国还是坚持告老还乡了，七十多岁病故于家。

其子于永继承了父亲的爵位，也继承了父亲的酒量，但与父亲不同的是，父亲喝酒神思清爽不乱，但于永做不到。但于永还是有这一个家族的那份德行上的操守，父亲死后，他居丧如礼，以孝名闻乡里。居丧后升迁为御史大夫，并娶宣帝长女馆陶公主为妻。后成帝想任他为丞相，不巧于永薨逝。其子于恬远不如其父辈，在史书上仅仅留下“不肖，薄于行”五个字。