教材研究：试题中经常会出现核移植技术，但集中在哺乳动物的核移植，其实教材中出现了两栖类动物的核移植，核移植技术的发展过程也已经经过了几十年。核移植技术和动物的克隆有着紧密的联系，核移植技术的过程需要适当了解。

一、核移植

核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制，培养一段时间后，再把发育中的卵母细胞移植到人或动物体内的方法。

由于细胞核移植是产生克隆动物的有效方法，故人们往往把它称为动物克隆技术。 

核移植的细胞来源主要分为：供体细胞来源和受体细胞的来源两种。

二、蛙的细胞核移植

1、受体卵的准备

（1）去膜： 经人工催产使蛙卵成熟。挤出成熟的蛙卵，逐个去掉卵胶膜，接着把卵整齐地排列在高温灭菌过的培养皿内，使其粘于皿底。并使卵子动物极朝上，以便进行激动和挑核。然后加入适量的手术液，每次可在一个培养皿内排列卵25-40个。

（2）激动： 蛙卵在未受精前仍处于第二次成熟分裂的中期。为了使卵子完成第二次成熟分裂，排出第二极体，在双目解剖镜下，用一枚消毒过的玻璃针在动物极靠近赤道的地区浅刺一下，目的是代替自然受精时精子入卵的过程。由于针刺动作比精子入卵的速度快得多，所以针刺手术要轻缓。激动后的卵子，10-15分钟后产生第二极体。在解剖镜下可见动物极附近有一折光的圆形小球，此即第二极体。

（3） 挑核： 当第二极体出现时，用一枚消毒过的玻璃针在极体处斜插入卵子表层，然后迅速提起针尖，由于卵黄膜的破裂，极体下的卵核随着一小部分细胞质流出卵外，形成一个卵外球，一般极体排出15分钟以后会逐渐消失。这样挑核应在极体出先后10分钟内完成，否则核将沉入卵子中心，去核手术不易成功。

（4） 再去膜： 挑核后经过10分钟左右，待伤口基本愈合时，用两把磨的很尖的钟表镊子，渐次剥去卵外胶膜，直至余下一层受精膜为止。操作步骤如下：在双目解剖镜下，先将一把尖头镊子的一边尖端从卵子附着皿底的胶膜处小心而快速地插入到最内层胶膜，然后夹紧胶膜，把卵固定住，再用另一把镊子从卵子另一侧夹紧胶膜，向上向后把胶膜掀去，若用两把镊子左右对拉，则易损伤卵子，且使卵质变位，影响胚胎发育。 剥膜后的卵子移到盛有手术液的培养皿中置于玻璃板上，供注核用。

2、供体细胞的分离

取囊胚或早期原肠胚的外胚层作为供体细胞。先在滤纸上除去胶膜，然后移入皿底涂有一层琼脂的并盛有分离液的培养皿中，用两把镊子剥去胚胎外余下的各层胶膜，切下外胚层，吸去不用的胚胎部分。一个很小的组织块放在分离液内数分钟，并轻轻摇动，细胞便可自行分散。如不分散，可用毛细吸管轻轻吹打。 分散后的胚胎细胞用毛细吸管移到盛有手术液的培养皿中，置于涂有琼脂的小载玻片上，作为移植时的供体细胞。

3、核移植

（1）显微注射器的准备： 每次手术前应向显微注射器的整个管道系统灌入手术液或双蒸水，检查管道的各衔接处有否漏气。管内只要有一极小的气泡，注射器的调节就失灵。同时应注意选择弹簧上弹性较灵敏的部位以便操作准确。

（2） 微型吸管的制备： 吸管最好用软质玻璃管。制作前，先将玻管用洗液洗净，再用蒸馏水彻底将酸洗去。这样可使拉出的微吸管内部洁净，不致影响细胞核的吸入和射出。将玻管拉成口径1mm的细管，然后在微火焰上，再拉成微吸管，管径在10-20微米之间。

（3）吸细胞核： 吸核的方法不是将微吸管头刺入供体细胞内吸取细胞核，而是利用显微操纵台通过轻轻地来回转动千分尺外径，将一个细胞慢慢地吸入微吸管。必须注意微吸管的内径要比细胞小，这样能使被吸入的细胞由于吸力的作用而破裂，结果可以依靠目测，将细胞核和包在它周围的一部分细胞质一起吸入管内，避免细胞核直接与液体接触，以免受损。还应调节使供体细胞尽量靠近管口，避免注核时带入较多的手术液。

（4）注核： 将吸有供体细胞核的微吸管在离动物极45度左右的地方刺入动物半球的中心，再稍微向上提一下管口，然后轻轻地推动微量注射器，把管内的细胞核连同周围的细胞质慢慢地注入卵内。如果注射速度太快，注入卵内的压力过大，则会使卵子破裂，导致实验失败。 一般从首次去胶膜到注完15个左右的核，需2-2.5小时，时间过长，将会影响移核卵的发育。

（5） 培养观察： 移核后的卵子转入1/10 Holtfreter 液中，置25恒温箱中培养。及时观察卵子的发育并做好记录。

（6） 用同批卵按常规人工授精的方法获得受精卵，置培养皿中在同等温度条件下培养，以便与移核卵作对比观察。

三、哺乳动物的细胞核移植

1、 取卵。

2、 去核卵的制作

用白色小鼠的受精卵作受体，在有相差干涉装置的显微镜下，将预先备好的移核针管头端，借助显微操作器刺入受精卵的透明带，让针头仅穿过透明带而不刺破卵子的质膜。再用针口对准雄核，隔着质膜将其吸入针管内。然后将针口对准雌核，以同样的方法将雌、雄原核吸至针管前端，随即慢慢拔出针管。此时可见到卵子质膜弹性很大，在管口与透明带之间质膜被拉成细丝，然后断开，形成只有细胞质的去核卵和在针管内有两个原核和少量细胞质，外有质膜包裹的两个部分。该去核卵即作受体用。

3、细胞核移植

用同法将作供体的黑小鼠受精卵的雌、雄原核吸入针管内，然后吸入少许仙台病毒，再将上述针管移至去核卵，让管口穿过透明带原有的小孔进入卵周隙，此时轻轻转动注射器，使外有质膜包裹的雌、雄原核和仙台病毒一起进入受体卵的透明带与质膜之间的卵周隙，然后把针管缓缓抽出即可。如继续观察，能见到在病毒的作用下，移入细胞核所带的质膜与去核的质膜接触处，质膜慢慢溶化消失，雌、雄原核进入受体卵的融合过程。该移核卵子，实际是核质杂交。如果操作成功，在二氧化碳培养箱内培养， 90%以上的卵子可发育至胚泡期，经过胚胎移 植可获得核移植的核质杂交小鼠。 在核移植的全过程中，每一步骤均需严格操作，尽量减少对细胞膜、质和核的损伤，所用的器皿也需严格消毒，防止污染，以提高各个步骤的成活率。

四、核移植技术发展简史 

采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由汉斯·施佩曼在1938年提出，他称之为“奇异的实验”，即从发育到后期的胚胎（成熟或未成熟的胚胎均可）中取出细胞核，将其移植到一个卵子中。这一设想是现在克隆动物的基本途径。 

从1952年起，Briggs 和King在两栖类动物中首次获得核移植成功,首先采用青蛙开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。

英国牛津大学的科学家在1960年和1962年，先后用非洲一种有爪的蟾蜍（非洲爪蟾）进行过克隆试验。试验方式是先用紫外线照射爪蟾卵细胞，破坏其中的核，然后依靠高超的外科手术从爪蟾蝌蚪的肠上皮细胞、肝细胞、肾细胞中取出核，并把这些细胞的核精确地放进已被紫外线破坏了细胞核的卵细胞内，经过精心照料，这些换核卵中终于有一部分长出了活蹦乱跳的爪蟾，这种爪蟾也不是经过精细胞和卵细胞州结合产生的，所以也是克隆爪蟾。

1963年，中国童第周教授领导的科研组，首先以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。

1964年，英国科学家格登（J.Gurdon)将非洲爪蟾未受精的卵用紫外线照射，破坏其细胞核，然后从蝌蚪的体细胞——场上皮细胞中吸取细胞核，并将该核注入核被破坏的卵中，结果发现有1.5%这种移核卵分化发育成为正常的成蛙。格登的试验第一次证明了动物的体细胞核具有全面性。

哺乳动物胚胎细胞核移植研究的最初成果在1981年取得——卡尔·伊尔门泽和彼得·霍佩用鼠胚胎细胞培育出发育正常的小鼠。

中国著名生物学家童第周先生在1978年成功地进行了黑斑蛙的克隆试验，他将黑斑蛙的红细胞的核移人事先除去了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵最后长成能在水中自由游泳的蝌蚪。

1979年春，中国科学院武汉水生生物研究所的科学家用鲫鱼囊胚期的细胞进行人工培养，经过385天59代连续传代培养后，用直径10微米左右的玻璃管在显微镜下从培养细胞中吸出细胞核，在此同时，除去鲫鱼卵细胞的核，让卵细胞留出空间作好接纳囊胚细胞核的准备，一切准备就绪后，把玻璃管吸出的核移放到空出位置的鲫鱼卵细胞内，得到了囊胚细胞核的卵细胞在人工培养下大部分夭亡了，在189个这种换核卵细胞中，只有两个孵化出了鱼苗，而最终只有一条幼鱼度过难关，经过80多天培养后长成8厘米长的鲫鱼。这种鲫鱼并没有经过雌、雄细胞的结合，仅仅是给卵细胞换了个囊胚细胞的核，实际上是由换核卵产生的，因此也是克隆鱼。 

Mcgrath和Solter 在1983年发表了用核移植技术与细胞融合相配合的方法，能将90%以上的移核卵培养到胚泡期。经过胚胎移植，均可获得一定比例的核移植小鼠。

1984年，施特恩·维拉德森用取自羊的未成熟胚胎细胞克隆出一只活产羊，其他人后来利用牛、猪、山羊、兔和猕猴等各种动物对他采用的实验方法进行了重复实验。

1989年，维拉德森获得连续移核二代的克隆牛。

1994年，尼尔·菲尔斯特用发育到至少有120个细胞的晚期胚胎克隆牛。

到1995年，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，包括冷冻和体外生产的胚胎；对胚胎干细胞或成体干细胞的核移植实验，也都做了尝试。但到1995年为止，成体动物已分化细胞核移植一直未能取得成功。

1996年2月27日出版的英国“自然”杂志公布了爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经过247次失败之后，他们在前年7月得到了一只名为“多利”的克隆雌性绵羊。

威尔莫特等学者先给“苏格兰黑面羊”注射促性腺素，促使它排卵，得到卵之后，立即用极细的吸管从卵细胞中取出核，与此同时，从怀孕三个月的“芬多席特”六龄母羊的乳腺细胞中取出核，立即送人取走核的“苏格兰黑面羊”的卵细胞中，手术完成之后，用相同频率的电脉冲刺激换核卵，让“苏格兰黑面羊”的卵细胞质与“芬多席特”母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在试管里经历受精卵那样的分裂、发育而形成胚胎的过程，然后，将胚胎巧妙地植人另一只母羊的子宫里。到去年7月，这只“护理”体外形成胚胎的母羊终于产下了小绵羊“多莉”。“多莉”不是由母羊的卵细胞和公羊的精细胞受精的产物，而是“换核卵”一步一步发展的结果，因此是“克隆羊”。 

链接：动物克隆繁殖的发展过程