学生的问题：学生对基因工程中如何筛选重组DNA导入受体细胞，感觉很难理解，影响了如何用限制性核酸内切酶提取目的基因所需酶的理解，通常情况下，为什么要用两种抗性基因，切割其中一种抗性基因。下面以导入人生长激素基因的大肠杆菌培养为例。

一、原理：

作为载体上要有两个标记基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，其中氨苄青霉素抗性基因被限制酶切割，插入生长激素基因，形成的重组 DNA 分子由于生长激素基因的分隔使氨苄青霉素抗性基因失活。

二、步骤：

（1）将处理的大肠杆菌放在培养瓶中进行扩大培养，然后将大肠杆菌接种到含有四环素的培养基上培养，筛选出含四环素抗性基因的大肠杆菌（含有重组 DNA 的大肠杆菌和不含目的基因含有普通质粒的大肠杆菌两种），然后将筛选出的菌落通过稀释涂布平板法接种到含四环素培养基 E 中培养，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。

 

（2）然后利用“影印法”把含四环素培养基的菌落接种到既含氨苄青霉素又含四环素的培养基 D 的相同位置培养，比较 DE 培养基上的菌落数量和位置。

结果和相应的结论：E 培养基上有两个菌落在 D 培养基的相同位置没有，没有的这两个菌落就是含有目的基因的大肠杆菌。

三、解释：

因为含有目的基因的大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因失活，在含有氨苄青霉素的培养基上不能繁殖，所以含氨苄青霉素和四环素培养基上菌落和只含四环素的培养基菌落数不同，在氨苄青霉素和四环素的培养基没有生长。

四、例题：

目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一 所示。

 

（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于                     。

（2）pBR32Z分子中有单个EcoRI限制酶作用位点，EcoRI只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRI的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRI切割后所形成的黏性末端            。

（3）pBR322分子中另有单个的BamHI限制酶作用位点，现 将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶BgIⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复          键，成功的获得了重组质粒。说明                                        。

（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无amp^R和tet^R的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是                 ，图三结果显示，多数大肠杆 菌导入的是                  。

答案：（1）筛选（鉴别目的基因是否导入受体细胞）  

（2）

 

  （3）磷酸二酯键    两种限制酶（BamHⅠ和Bg1Ⅱ）切割得到的黏性末端相同

  （4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322质粒