试题研究：最近试题中出现用纸层析法测定叶绿素含量，其实，这种方法主要用于定性分析（个人观点，可以把分离的色素带，剪下来进行测定）。如果定量分析，方法有多种，如现在可以用传感器测定等，一般用分光光度计法，摘录网上的以“分光光度计法”测定叶绿素含量的方法内容，以便学习。

一、实验原理

叶绿体色素（叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素、叶黄素）不溶于水而溶于有机溶剂，故要用丙酮或乙醇提取。提取液中叶绿素含量与该液色泽和消光度（光密度）成正相关。

根据叶绿素a和叶绿素b的吸收光谱曲线不同，本法采用分光光度计分别在它们的最大吸收波长下测定提取液的消光度，根据公式先求得提取液中叶绿素a、b和二者的总量，然后再根据取样数量和稀释倍数计算出组织中叶绿素含量。

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。

今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下（如665nm、645nm和652nm）的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、实验试剂

 1. 96％乙醇（或80％丙酮）

2. 石英砂

3. 碳酸钙粉

三、实验设备 

1. 分光光度计

2. 电子顶载天平（感量0.01g）

3. 研钵

4. 棕色容量瓶

5. 小漏斗

6. 定量滤纸

7. 吸水纸

8. 擦境纸

9. 滴管

四、实验材料 

新鲜（或烘干）的植物叶片。

五、实验步骤 

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

6. 实验结果计算：

将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665 －6.88A649 ；Cb=24.96A649 －7.32A665 。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：

叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。