疑难问题：复习资料“对细菌进行计数只能采用涂布分离法，而不能用划线分离法”，这句话认为是错误的。都知道划线分离法是不能用来计数的，因为只有划线的后期才有可能是单菌落，此话错在“细菌进行计数只能采用涂布分离法”，那么细菌的计数方法有哪些？

测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法等。

1．计数板测定法（必修3第71）

即用血细胞计数板进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数板的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm³），因而根据计数板刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。

本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。

2．比浊法（必修3第71）

比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度（OD值）表示样品菌液浓度。

此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。

3．活细胞计数法（选修1—涂布分离法）

常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。

此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。

使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入０.001%2，3，5一氯化三苯基四氮唑（TTC）；③本法限用于形成菌落的微生物。

广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。

4．电子计数器计数法

电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。

该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。

5．测定细胞重量法

此法分为湿重法和干重法。

湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。

此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。

6．测定细胞总氮量或总碳量

氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。

7．颜色改变单位法（CCU）

这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用菌落形成法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作：

（1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。

（2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管。

（3）于37℃培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如，第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10⁶CCU/ml。

一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。