第一部分  微生物的利用

本部分课标要求：进行微生物的分离和培养。

实验1：大肠杆菌的培养和分离

一、教学要求

基本要求	1．进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2．进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。
发展要求	说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
说明

二、基本内容

1．培养基的种类和化学成份

培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种分离，鉴定，计数（菌落数量）。

培养基的化学成分包括 水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。

2．无菌技术

对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

灭菌方法：

        接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。

        玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。

    培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。

        表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。

3．实验操作步骤

（1）配制培养基：计算→称量→熔化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板（形成斜面是为增大接种面积）。

 一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤：

 称量：准确称取各成分。配置LB固体培养基时还需加 1g琼脂。

 熔化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

 调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。

 灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，（121）1kg/cm²压力灭菌15min。

 倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

 （2）接种

 微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。

 平板划线法（方法简单，考试的主要考查点）：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面（也是分离纯化的方法）。在第一次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

 划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。

 划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。

 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

 稀释涂布平板法（操作复杂，单菌落更易分开）：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。

涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10^－5 ～10^－7之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

（3）培养

 平板倒置放在培养箱中培养是为了使水分蒸发形成的水蒸气凝结成的水滴滴留在盖上，同时防止水滴入培养基并扩散开，已形成的菌落随水扩散，相互影响。

（4）观察结果（菌落数量、特征等）并分析、评价

5．讨论和思考（P24）

 （1）如何操作可以尽量避免被杂菌污染？

 答：胆大心细，操作快捷。注意灭菌操作原则，灭菌彻底。手和实验服要清洁。注意微生物生长条件。

 （2）在培养后如何判断是否有杂菌污染？

 答：可根据菌落形态特征来判断。用显微镜镜检菌的形态和大小。上述方法较难区分同类的物种，需要用化学方法进一步观察，如用革兰氏染色法。

 （3）进行恒温培养时为什么要培养皿倒置？

 答：冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

 （4）实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？

 答：实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。

 实验2   分离以尿素为氮源的微生物

一、教学要求

基本要求	1．进行微生物分离，使用含有尿素的培养基分离有脲酶的细菌。 2．使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。
发展要求	1．说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。 2．举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。
说明

二、基本内容

1．实验原理：

本实验以LB全营养培养基与尿素固体培养基为对照，通过观察两者的细菌菌落数说明能利用尿素的细菌在土壤菌群中较少。这两种培养基在配制时均要用琼脂糖代替琼脂使之固化。另外，由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用G6玻璃漏斗过滤的方法。在尿素固体培养基中还要加入酚红，这是一种酸碱指示剂，有脲酶的细菌菌落周围会出现着色的环带。 

2．实验步骤：

（1）土壤取样 

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

（2）制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

（3）制备细菌悬液

参考课本中P26图5的实验流程示意图，将1 g土样加入盛有99mL无菌水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液0.5mL，转移至盛有4.5 mL的无菌水的大试管中，依次等比稀释至10^－4和10^－5稀释度，并按照由10^－4和10^－5稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作，各做三个培养皿。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

（4）微生物的培养与观察

将涂布好的培养皿放在37 温度下培养24—48h。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生着色的环带的颜色反应。

3．讨论和思考（P28）

（1）为什么本实验中要用琼脂糖来代替琼脂配制固体培养基呢？琼脂糖与琼脂有何区别？

答：琼脂在制作固体培养基时起凝固剂的作用。但它却是一种未被纯化的混合物，里面有一定量的含氮化合物。在本实验中所使用的尿素培养基却要求提供氮元素的物质只有尿素，用这种培养基才能分离得到含脲酶的细菌。若用琼脂来制备本实验的尿素固体培养基，则提供氮元素的物质除了尿素还有琼脂，用这种培养基就不难只得到含脲酶的细菌，还会得到大量以非尿素为氮源的细菌，这样就达不到分离出以尿素为氮源的细菌这一实验目的了。所以要将琼脂纯化，去除那些含氮化合物，这样经纯化得到的琼脂糖就可以代替琼脂做固体剂且不会带来含氮化合物对本实验的干扰了。

（2）有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？

答：有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的NH₃会使土壤变成碱性，NH₃与其他阴离子物质如CO、NO等形成化合物，则会使土壤板结。

（3）有脲酶的细菌周围会为什么出现着色的环带？

答：细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中是黄色，在碱性环境中是红色。

（4）与全营养培养基上的菌落比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？

答：全营养培养基数量和种类都明显多于尿素培养基上的。因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。

（5）本实验的微生物分离与上一实验中大肠杆菌的分离实质上一样吗？

两者的细菌分离有很大的不同。

实验1：大肠杆菌培养和分离，利用划线分离法，从同种菌种中分离得到同种菌的单菌落，在划线的末端出现大肠杆菌单菌落。

实验2：分离以尿素为氮源的微生物，利用涂布分离法，从土壤浸出液里所存在的各种细菌中只将含有脲酶的细菌分离出来，只出现含有脲酶的细菌菌落。 

第二部分  酶的应用

本部分课标要求：

1．研究酶的存在和简单制作方法。

2．尝试利用酶活力测定的一般原理和方法。

3．探讨酶在食品制造和洗涤等方面的应用。

4．尝试制备和应用固相化酶

实验4  果汁中的果胶和果胶酶

一、教学要求

基本要求	1．得出制作果汁的最佳条件。 2．检测果胶酶的活性，观察果胶酶对果汁形成的作用。
发展要求	收集果胶酶在其他方面利用的资料。
说明

二、基本内容

1．实验原理

果胶是植物细胞壁的以及胞间层的主要成分之一，由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。

山楂的果实中果胶含量最多，煮沸的山楂泥可制成山楂糕，就是由于果胶的作用。果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，去掉果胶，就会使植物组织变得松散。

果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。

果胶酶和果胶甲酯酶可水解果胶，瓦解植物的细胞壁和胞间层。有些微生物，如黑曲霉、苹果青霉等都可用于生产果胶酶。在果汁生产中应用果胶酶可以提高出汁率(果汁量）和澄清度。

2．实验步骤

（1） 制备水果浆，配制果胶酶。

（2） 取两个100ml的烧杯，编号A、B，各加入5 g 匀浆液，再向A烧杯中加入10ml果胶酶溶液，B烧杯中加入10ml清水。

（3） 取4支试管，编号1～4。在1、2号试管中各加4ml A烧杯中的混合物；在3、4号试中各加4ml B烧杯中的混合物。

（4） 将1、3号试管加热，2、4号试管不加热，观察澄清度的变化。

（5） 再向4支试管中各加95%的乙醇4ml，观察变化。

3．讨论和思考（P35）

（1）制作果汁的最佳条件是什么？

答：制作果汁的最佳条件是方法要温和，且对人体无害，能使最多的水果成分溶解或分散在果汁中，能尽量保留水果的营养成分，具有水果的原始色彩和口味；有更多的固形物，分散程度好，不沉淀，不上浮；除去所有的机械组织，更易消化。

（2）果胶酶在制作果汁中起什么作用？

答：可将细胞离析，增加固形物的分散度。降低水果匀浆悬液黏度，有利于过滤掉不溶物，并使果胶分解成半乳糖醛酸。

（3）果胶酶还可能起什么作用？

答：果酒澄清，同时也作为洗衣粉的添加剂，有利于洗去衣服上的果汁等污垢。

（4）果胶酶水解果胶的最终产物是什么？要使果汁澄清，是否应该同时使用果胶酶和果胶甲酯酶中的哪一种？还是同时使用两种酶？为什么？

答：果胶酶水解果胶的最终产物是半乳糖醛酸，要使果汁澄清，应该同时使用果胶酶和果胶甲酯酶。从微生物中获得的果胶酶都包括这两种酶。因为，如果不使用果胶完全降解成半乳糖醛酸，则不可能减少组织的分散性，许多水果中的固形物不能除去，这样会降低果汁的营养成分，也影响其澄清度。

实验6   α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

一、教学要求

二、基本内容

1．实验原理

固定化酶：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

酶的固定化方法：物理吸附法：将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等；包埋法：将酶包裹在多孔的载体中，包埋成格子型或包埋成微胶囊型；化学结合法：将酶分子相互结合，或将其结合到纤维素、琼脂糖，离子交换树脂等载体上的固定方式。

2．实验步骤

（1）α淀粉酶的固定化。5mg α淀粉酶溶于4ml蒸馏水，加入5mg石英砂，搅拌30min。

（2）将石英砂装入含气门心并用夹子封住的注射器中。用40ml蒸馏水用流速1ml/min来洗涤除去未吸附的游离淀粉酶。

（3）使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱，在流出5ml后接收0.5ml流出液。加入1-2滴KI-I₂溶液，观察颜色变化。

实验预期结果：水解产物糊精遇碘呈红色。

3．讨论和思考（P40）

（1）如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶？

答：可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。

（2）耐高温的淀粉酶有哪些可能的用途？

答：在高温下使淀粉水解快，不会因为温度高而失活，发酵生产中经常要用到植物淀粉水解。

第三部分  生物技术在食品加工中的应用

本部分课标要求：

1．运用发酵食品加工的基本方法。

2．测定食品加工中可能产生的有害物质。

                          实验8 果酒及果醋的制作

一、教学要求

二、基本内容

酿酒和制醋有关的微生物分别是酵母菌（真菌）和醋杆菌（细菌）。

1．果酒制作原理

（1）利用的微生物是酵母菌，其异化作用类型是兼性厌氧型，酵母菌发酵的反应式：

        有氧条件：C₆H₁₂O₆+6O₂+6H₂O →12H₂O+6CO₂+能量

        无氧条件：C₆H₁₂O₆ → 2C₂H₅OH+2CO₂+能量

（2）影响酒精发酵的主要环境条件有温度、氧气和pH。

    酒精发酵是一般将温度控制在25～30范围内。

    酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性环境。

2．果醋制作原理

（1）利用的微生物是醋酸菌，为异养需氧型。在氧气和糖源都充足时，降糖分解形成醋酸；当缺少糖源时可将乙醇转变成乙醛，并进一步转变成醋酸。

醋酸发酵的反应式：  C₂H₅OH+O₂ →H₂O+CH₃COOH

（2）醋酸发酵需要适宜温度、pH 和氧气。

（3）在醋酸发酵过程中，特别需要注意要从充气口持续向发酵液中补充氧气（无菌空气）。

安装果醋发酵装置时，要注意连接口的密封性，以免被杂菌感染，同时要注意进口处与出口处的流速，以保证醋酸的充分氧化。在醋酸的发酵过程中，要注意经常用pH试纸检测流出液中的pH值，以监控发酵过程的进行。

3．讨论和思考（P48）

（1）葡萄或其他果实上常有天然的野生酵母存在，为什么上述两个实验都要接种酵母？

答：用葡萄制作葡萄酒时，一般不加蔗糖，都只用野生酵母，但是本实验为了加速反应，使观察更直观，需要有更多底物参加反应，所以加入酵母使酒精发酵占有优势。否则有霉菌生长，出现异味，影响质量。

（2）为什么发酵瓶中的液体不能装满？

答：发酵瓶中的液体不能装满是因为发酵过程中气体产生，如果装满会使液体外溢，导致发酵液损失和瓶口等处污染杂菌，影响产物品质。

（3）P46图12中装着水的弯曲玻璃管起什么作用？

答：用装着水的弯曲玻璃管可以防止氧气进入，发酵产生的二氧化碳可以出去，还可以防止空气中杂菌的污染。

（4）制酒时必须保证所有用具都是清洁的，为什么？

答：杂菌生长，产物是不是单纯的果酒。

（5）为什么要向发酵瓶中通入空气？

答：制醋时要向发酵瓶中通入空气，保证发酵是一个氧化过程。

（6）为什么要用棉花过滤？

答：要用棉花过滤是防止空气中的微生物进入。

（7）你所得到的丙瓶中的液体是否就是市售的白醋？为什么？怎样才能得到白醋？

答：不是，市售白醋中除醋酸外，还含有丰富的不挥发性酸、糖、酯、醇等物质，这些物质多为加入的酵母所产生。在生产中将一部分丙瓶产物加工成成品。

（8）酒精发酵过程中往往“先通气后密封”？

答：“通气”的目的是使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖。“密封”的目的是使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。在酒精发酵过程中，每隔一段时间（12h）拧松瓶盖或打开排气口，是为了防止在发酵过程中产生CO₂ ，使瓶内气压过高引起爆裂。排气口胶管长而弯曲的作用是防止空气中杂菌感染。

实验10 泡菜的腌制和亚硝酸的测定

一、教学要求

基本要求	1．进行泡菜的腌制。 2．测定泡菜中亚硝酸的含量。
发展要求	讨论相关的食品安全问题

二、基本内容

1．实验原理

（1）泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌，在无氧条件下，降糖分解为乳酸 。

反应式为：C₆H₁₂O₆  → 2C₃H₆O₃+能量  

所用原料是白菜、洋白菜等。在无氧的条件（由所用容器的凹槽加水在加盖造成）下，微生物利用菜中的糖和其他营养物进行发酵，乳酸菌将糖分转化为乳酸。当有机酸增加到一定程度时，乳酸菌被杀死，出现酵母和霉菌，并逐渐产生亚硝酸。加白酒的作用是可抑制杂菌的生长，也是一种调味剂，增加醇香感。加盐不要太多，否则会使乳酸菌发酵迟缓。温度高则发酵快，但口味差些。

（2）亚硝酸盐是对人体有害，引起中毒，可致癌的物质，由假丝酵母产生。可与对氨基本磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N—1—萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量。

测定亚硝酸盐含量实验步骤包括样品处理、测定、标准曲线（以亚硝酸钠质量为横坐标以光密度OD值为纵坐标）、计算[亚硝酸盐含量（mg/kg）X₁=通过标准曲线得到的亚硝酸盐质量（ug）m₂×1000×样品处理液总体积V₁/样品质量m₁×测定样品液总体积V₂×1000）]。

    测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。

   一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好。

实验结果分析和讨论

在腌制后的前6天内，泡菜中的亚硝酸盐含量就可以达到最高峰。而第9天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降。这可能是由于泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于某些细菌的繁殖（包括一些硝酸盐还原菌），这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，造成泡菜中亚硝酸盐的含量又有所下降。

2．实验步骤

（1）各种菜洗净并切成3～4cm长的小块。

（2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。

（3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀。如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸1分钟后入坛，再加上一些白酒。

（4）将坛口用水封好，防止外界空气进入。

（5）泡菜发酵。

（6）如果加入一些已经腌制过的泡菜汁更好，这相当于接种已经扩增的发酵菌，可减少腌制时间。

3．讨论和思考（P55）

（1）加入白酒有什么作用？

答：白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。

（2）用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？

答：水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，空气中21％是氧气，这是最简易的造成无氧环境的方法。这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。

（3）厌氧呼吸和需氧呼吸发酵的产物有什么不同？

 答：酵母菌厌氧呼吸产生的酒精，乳酸菌厌氧发酵产生的乳酸，醋酸菌产生乙酸属于有氧发酵。

第四部分   浅尝现代生物技术

本部分课标要求：尝试植物的组织培养。

                            实验11  植物的组织培养

一、教学要求

基本要求	1．进行菊花的组织培养。 2．尝试植物激素的应用。
发展要求
说明

二、基本内容

1．原理：植物细胞的全能性。

2．影响植物组织培养的条件

（1）材料

植物的种类、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。

（2）激素

在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。 

（3）营养

常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Cl、Ni、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。培养基中通常加一定量的蔗糖是除作为营养成分外，还用于维持一定的渗透压。

（4）环境条件

PH、温度、光等环境条件。

3．操作流程

培养过程应该在无菌的条件下进行，实验经过外植体—愈伤组织—丛状苗—生根苗—移栽植株。需要一定的光照和温度的条件。

（1）配制MS固体培养基

 最常用的MS培养基（生芽培养基、生根培养基）。配制过程包括称量、溶解、调PH、融化、分装（三角瓶）、加盖灭菌等步骤。

 配制各种母液：将各种成分按配方比例配制成的浓缩液。使用时根据母液的浓缩倍数，计算用量，并加蒸馏水稀释。

 配制培养基：应加入的物质有琼脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，并用蒸馏水定容到1000毫升。在菊花组织培养中，可以不添加植物激素，原因是菊花茎段组织培养比较容易。

 灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

（2）外植体的消毒

 消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡10min，再放入5%次氯酸钠浸泡5min，然后用另一5%次氯酸钠浸泡5min。消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。

（3）接种

 接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种7～8个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。

（4）培养

应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度和光照。

（5）移栽

栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

（6）栽培

外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底，培养基灭菌不彻底，接种中被杂菌污染，锥形瓶密封性差等。

4．讨论和思考（P61）

（1）不同植物、不同组织的生根和生芽是否都可使用与本实验相同的生长素和细胞分裂素浓度？

答：不可，都要探索出使用何种浓度，不同的材料不一样。

（2）本实验中不用天然激素而是用人工合成的激素，为什么？

答：但实验中不用天然激素而是用人工合成的激素（如萘乙酸NAA、6—苄基氨基腺嘌呤等）是因为植物中存在相应的分解天然激素的酶而没有人工合成激素的相应的酶，所以天然激素在植物体内作用和存在的时间短，人工合成激素的作用和存在的时间长，作用效果明显。