疑难试题：在植物的细胞培养中，有多种方法可提取原生质体。原生质体的分离与培养成功解决了植物组织培养、植物克隆等方面的难题，标志着植物细胞工程技术向前迈进了一大步。以下说法正确的是（ D ）

A．提取原生质体唯一有效的办法是酶解法

B．把原生质体放入高渗溶液中，可正常膨大

C．通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但不是遗传转化的理想受体

D．原生质体的获得再一次证明植物细胞质壁分离现象的存在

分析：A提取原生质体唯一有效的办法是酶解法是错的，我查阅资料，发现还有机械处理的方法。B正常膨大是错的，通过原生质体融合再生植株可克服远缘杂交的不亲和性，但是遗传转化的理想受体，所以C错。

那么酶解法的方法是如何操作的？

一、方法步骤

叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。

二、原生质体的培养

1、培养基

MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇

注意：

（1）原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。

（2）针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。

2、影响原生质体培养的因素

营养需求（NH4^＋不能过多），渗压剂，培养密度（10⁵/mL），贮藏条件（通常在黑暗处）。

3、培养方法

液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。

4、固体培养的步骤

原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（ 40）的培养基混和→倒转培养皿在25下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。

5、原生质体分离培养的意义

（1）除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。

（2）原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。