人扁桃体动脉内皮细胞分离和培养的注意事项有哪些？

 

人扁桃体动脉内皮细胞的分离和培养对操作精度、环境控制及细胞特性维持要求较高，稍不注意可能导致细胞污染、活性降低或纯度不足，以下是关键注意事项：

 

一、样本处理与伦理规范

 

1、伦理与样本质量

 

必须获得伦理委员会批准及患者知情同意，明确样本来源的合法性（如扁桃体切除术标本需排除传染性疾病）。

 

样本需新鲜处理：扁桃体组织离体后应在 2 小时内送至实验室，若延迟需用含双抗的冰冷 PBS 或培养基保存（4，不超过 6 小时），避免组织缺血坏死影响细胞活性。

 

2、无菌预处理

 

组织表面用 75% 酒精快速擦拭消毒（10-15 秒），再用含高浓度双抗（青霉素 - 链霉素终浓度 200 U/mL）的 PBS 反复冲洗 3-5 次，彻底去除表面血迹、黏液及可能的微生物污染。

 

二、血管分离的关键细节

 

1、解剖操作

 

需在解剖显微镜下精细分离动脉：扁桃体组织中血管较细，避免误剪或过度牵拉导致内皮细胞损伤。

 

剥离动脉外膜的结缔组织时，尽量保留完整的内膜层（内皮细胞位于内膜最内层），减少杂细胞（如平滑肌细胞）混入。

 

2、组织块大小

 

动脉段剪碎至 0.5 mm 左右为宜：过大不利于酶消化，过小可能破坏细胞完整性。

 

三、酶消化的控制

 

1、消化试剂选择与浓度

 

优先用胶原酶 或 型（0.1%-0.2%），避免用胰蛋白酶直接消化组织（易损伤内皮细胞）；若后续传代用胰酶，需严格控制浓度（0.25%）和时间。

 

消化液需预热至 37，避免低温刺激细胞。

 

2、消化时间把控

 

胶原酶消化通常 30-60 分钟，期间每 15 分钟轻轻震荡一次，镜下观察组织块边缘是否松散（避免过度消化导致细胞破裂）。

 

终止消化需及时：加入含 10%-20% FBS 的培养基，通过血清中的蛋白酶抑制剂终止酶活性。

 

四、原代培养的环境优化

 

1、培养基与添加剂

 

用内皮细胞专用培养基或添加内皮细胞生长因子（ECGF，10-20 ng/mL）、肝素（50-100 μg/mL）的 DMEM/F12：肝素可抑制平滑肌细胞等杂细胞生长，ECGF 促进内皮细胞增殖。

 

FBS 需筛选：选择低内毒素批次（<0.1 EU/mL），终浓度 10%-15%（过高易导致杂细胞过度生长）。

 

2、培养表面处理

 

培养皿需预包被明胶（0.1%）或纤维连接蛋白（10 μg/mL）：内皮细胞依赖基质贴壁，未包被表面会导致贴壁率低、细胞形态异常。

 

3、培养条件稳定

 

incubator 需严格维持 37、5% CO、湿度 95%：温度波动 > 1或 CO浓度异常会导致培养基 pH 值改变，影响细胞存活。

 

原代培养前 24 小时不换液：避免干扰细胞贴壁（内皮细胞贴壁较慢，约 6-12 小时开始贴壁，24 小时后可见少量贴壁细胞）。

 

五、纯化与杂细胞去除

 

1、早期污染防控

 

若出现成纤维细胞（长梭形、排列无序）或平滑肌细胞（束状排列）污染，可在传代时采用差速贴壁法：将细胞悬液接种到未包被的培养皿，30 分钟后将未贴壁细胞（以内皮细胞为主）转移至新的包被皿中（成纤维细胞贴壁更快）。

 

避免频繁操作：原代培养初期细胞脆弱，过度晃动或换液会导致细胞脱落。

 

2、及时换液

 

培养 48 小时后首次换液，彻底去除未贴壁的死细胞、组织碎片及酶残留；后续每 2-3 天换液一次，保持培养基营养充足。

 

六、传代与冻存注意事项

 

1、传代时机与操作

 

细胞融合度达 80%-90% 时传代（避免过密导致接触抑制，影响增殖），传代比例 1:2 为宜（过高稀释会延长细胞恢复时间）。

 

胰酶消化时，镜下观察到细胞变圆、间隙增大即可终止（通常 1-2 分钟），避免消化过度导致细胞膜损伤；吹打细胞时用巴氏吸管轻柔操作，减少机械损伤。

 

2、冻存与复苏

 

冻存液配方：70% 培养基 + 20% FBS+10% DMSO（现配现用，DMSO 需梯度降温避免细胞结晶损伤）。

 

冻存过程：4 30 分钟→-20 1 小时→-80过夜→转入液氮（长期保存）；复苏时 37水浴快速解冻（1-2 分钟），立即加入培养基稀释 DMSO，离心后重悬接种。

 

七、细胞鉴定与质量控制

 

纯度验证

 

传代 2-3 次后需鉴定：通过免疫荧光检测 CD31、vWF 等内皮细胞特异性标志物（阳性率需≥95%），排除杂细胞污染。

 

功能验证：进行管腔形成实验，确认细胞功能正常。

 

八、其他注意事项

 

操作全程避免引入气泡：气泡会破坏细胞贴壁环境，导致局部细胞死亡。

 

避免频繁观察：减少培养箱开门次数，维持稳定的温湿度和 CO浓度。

 

传代限制：原代内皮细胞通常传至 5-6 代后会出现衰老、功能下降，建议在 3-4 代内使用，或早期冻存保种。

 

通过严格把控以上环节，可显著提高人扁桃体动脉内皮细胞的分离成功率、纯度及活性，为后续实验研究提供可靠的细胞模型。

 

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