微生物实验中选用和设计培养基的原则、方法及制备过程！

 

培养基是人工配制的、供微生物、植物组织或动物细胞生长繁殖及代谢研究的营养基质，其选用与设计直接影响培养效果。以下从原则、方法及制备过程三方面详细说明：

 

一、选用和设计培养基的原则

 

设计或选用培养基需围绕培养对象的需求、培养目的及实际应用场景，核心原则包括：

 

1、目的明确，适配培养对象

 

不同生物的营养需求差异显著，需针对性设计：

 

微生物：细菌（需碳源、氮源、无机盐，多数需中性 pH）、真菌（偏酸性 pH，可利用复杂碳源如淀粉）、放线菌（需高碳氮比，如淀粉为碳源）；

 

植物细胞：需无机盐（如 MS 培养基的大量元素和微量元素）、蔗糖、植物激素（生长素、细胞分裂素）；

 

动物细胞：需血清（提供生长因子）、葡萄糖、氨基酸，且渗透压需与细胞内液接近。

 

培养目的不同，配方差异大：基础培养（如牛肉膏蛋白胨培养基，维持基本生长）、选择性培养（如 SS 琼脂，抑制杂菌，筛选肠道菌）、鉴别培养（如伊红美蓝培养基，区分大肠杆菌与其他肠道菌）。

 

2、营养成分协调，比例适宜

 

核心营养物质（碳源、氮源、无机盐、生长因子）需齐全，且比例合理：

 

碳氮比（C/N）：细菌繁殖期需 C/N=5:1，产芽孢时需 C/N=20:1；真菌需更高 C/N（如查氏培养基 C/N≈10:1）。

 

无机盐浓度：避免过高导致渗透压失衡（如 NaCl 浓度过高抑制多数微生物），或过低影响酶活性（如 Mg²是多种酶的辅酶）。

 

生长因子：对营养缺陷型生物（如乳酸菌需维生素 B），需精准添加特定物质（如氨基酸、碱基）。

 

3、理化条件适宜

 

pH 值：需符合培养对象的耐受范围（细菌 6.5-7.5，真菌 5.0-6.0，动物细胞 7.2-7.4），可通过缓冲对（如磷酸二氢钾 / 磷酸氢二钾）稳定。

 

渗透压：与细胞内液相当（如动物细胞培养基渗透压约 280-320 mOsm/kg），避免细胞因渗透作用破裂或皱缩。

 

氧化还原电位：厌氧菌需低氧化还原电位（可加入巯基乙醇还原），好氧菌需充足氧气（培养基装量不宜过多）。

 

4、经济节约与可行性

 

大规模培养（如工业发酵）需优先选用廉价原料：如用玉米粉代替葡萄糖（碳源）、豆饼粉代替蛋白胨（氮源），降低成本。

 

原料稳定性：避免使用易变质或难储存的成分（如新鲜血清需低温保存，可替换为合成血清替代物）。

 

5、无菌与安全

 

制备过程需彻底灭菌，避免杂菌污染；

 

培养食用 / 药用生物（如益生菌、疫苗生产用细胞）时，原料需无毒无害（如禁用工业级化学品，选用食品级或医药级）。

 

二、选用和设计培养基的方法

 

培养基设计需结合理论依据与实验优化，具体步骤如下：

 

1、明确核心需求

 

确定培养对象（如大肠杆菌、烟草愈伤组织）和培养目的（如扩增、代谢产物积累、分离筛选）；

 

例：若需分离土壤中的固氮菌，因固氮菌可利用空气中的 N，培养基需不含氮源（选择性筛选）。

 

2、文献调研与营养需求分析

 

查阅该生物的已知营养特性：如是否为自养型（可利用 CO为碳源）或异养型（需有机碳源）；是否有营养缺陷（如某种氨基酸不能合成）。

 

参考同类培养基配方：如培养细菌先参考牛肉膏蛋白胨培养基，培养真菌参考马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。

 

3、配方设计与成分筛选

 

确定基础成分：

 

碳源：葡萄糖（速效）、淀粉（缓效）、甘油（适用于某些细菌）；

 

氮源：蛋白胨（有机氮）、硝酸铵（无机氮，适用于植物细胞）；

 

无机盐：提供 K、Na、Ca²、Mg²等；

 

生长因子：维生素（如 B 族）、氨基酸。

 

优化成分浓度：通过单因素试验（固定其他成分，调整某一成分浓度）或正交试验，确定各成分的最适浓度（如通过 OD 值、菌落直径判断生长状态）。

 

4、验证与调整

 

小规模试验：用设计的培养基培养目标生物，观察生长速度、代谢产物产量等指标；

 

排除干扰因素：如成分间的拮抗作用（如 Ca²与 PO³易沉淀，需分别溶解后混合）；

 

最终确定配方：兼顾效果与成本，形成可重复的标准化配方。

 

三、培养基的制备过程

 

培养基制备需严格遵循步骤，确保无菌性和稳定性，核心流程如下：

 

1、计算与称量

 

根据配方计算各成分的用量（如 1L 牛肉膏蛋白胨培养基需牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g）；

 

称量时使用分析天平（精密配方）或托盘天平（常规配方），避免误差过大。

 

2、溶解与混合

 

将称量好的成分加入适量蒸馏水（或去离子水）中，搅拌溶解；

 

特殊成分处理：

 

琼脂（固体培养基）：需加热煮沸至完全溶解（避免结块）；

 

难溶成分（如碳酸钙）：单独研磨后再溶解；

 

不稳定成分（如维生素）：暂不加入，待灭菌后单独处理。

 

3、调节 pH

 

用 pH 计或精密 pH 试纸检测，通过 1mol/L HCl 或 NaOH 溶液调整至目标 pH（如细菌培养基调至 7.0）；

 

注意：高温灭菌后 pH 会略有变化（通常下降 0.2-0.5），需提前预留缓冲空间。

 

4、过滤（可选）

 

对澄清度要求高的培养基（如动物细胞培养基），用滤纸或 0.22μm 滤膜过滤，去除杂质或未溶解的颗粒。

 

5、分装

 

根据培养需求分装到容器（试管、三角瓶、培养皿），注意装量（如三角瓶装量不超过容积的 1/2，避免灭菌时溢出）；

 

试管需加棉塞或硅胶塞（透气且防杂菌），三角瓶用纱布或透气盖密封。

 

6、灭菌

 

高压蒸汽灭菌：适用于大多数培养基（121、103kPa、15-30 分钟），可杀灭包括芽孢在内的所有微生物；

 

例外：含糖培养基需降低温度（115、30 分钟），避免糖分焦化；

 

过滤除菌：适用于不耐热成分（如血清、抗生素、维生素），用 0.22μm 滤膜过滤后，在培养基冷却至 50-60时加入（避免高温破坏）。

 

7、灭菌后处理与保存

 

固体培养基：灭菌后趁热倒平板（每皿约 15-20mL），冷却后倒置保存（防止冷凝水污染）；

 

液体培养基：冷却后 4保存，避免阳光直射；

 

无菌检查：随机取少量培养基，37培养 24-48 小时，无杂菌生长即为合格。

 

四、总结

 

培养基的设计需兼顾“营养适配性”“理化适宜性”和“实际可行性”，制备过程则需严格控制无菌性和成分稳定性。合理的培养基是微生物培养、细胞工程、发酵工业等领域的基础，直接影响实验或生产的效率与结果。

 

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