金黄色葡萄球菌的活化、保存与确认方法及注意事项！

 

百欧博伟生物：以下是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的活化、保存及确认方法的详细说明，结合实验室常规操作和生物安全要求：

 

一、活化方法

 

1、培养基选择

 

常用培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、脑心浸液琼脂（BHI）、血琼脂平板（含5%羊血）。

 

液体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或BHI肉汤。

 

2、操作步骤

 

冻存菌株复苏：

 

从-80甘油冻存管或冻干菌种中取少量菌液，划线接种于TSA或血琼脂平板。

 

37培养18-24小时，观察菌落形态（金黄色、光滑、圆形凸起）。

 

斜面菌种活化：

 

用接种环挑取斜面保存的菌苔，划线接种至新鲜平板或液体培养基。

 

37振荡培养（液体）或静置培养（固体）12-18小时。

 

3、注意事项

 

严格无菌操作，避免污染。

 

若菌种长期未活化，可能需多次传代恢复活性。

 

二、保存方法

 

1、短期保存

 

斜面保存：接种于TSA斜面，4保存，每1-2个月传代一次。

 

半固体穿刺保存：穿刺接种于含0.5%琼脂的TSB中，4保存1-3个月。

 

2、长期保存

 

甘油冻存法：

 

将对数生长期菌液与无菌50%甘油按1:1混合（终浓度15-25%）。

 

分装至冻存管，-80保存（可存活1-5年）。

 

冻干保存：真空冷冻干燥后密封，-20或更低温度保存（可达10年以上）。

 

3、注意事项

 

避免反复冻融，分装为小份使用。

 

保存前需验证菌株纯度。

 

三、确认方法

 

1、形态学鉴定

 

菌落特征：金黄色色素（部分菌株可能不产色素）、β-溶血（血琼脂平板）。

 

显微镜观察：革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。

 

2、生化试验

 

凝固酶试验（关键指标）：

 

玻片法：检测结合型凝固酶，与兔血浆混合后出现凝集。

 

试管法：检测游离型凝固酶，37孵育4小时内血浆凝固。

 

触酶试验：阳性（产生气泡）。

 

甘露醇发酵试验：多数致病株可发酵甘露醇（产酸变黄）。

 

3、分子生物学鉴定

 

PCR检测：扩增特异性基因。

 

MALDI-TOF MS：质谱快速鉴定。

 

4、补充试验

 

耐热核酸酶试验：阳性（琼脂孔周围出现透明环）。

 

显色培养基：如金黄色葡萄球菌培养基，菌落呈粉红色或紫色。

 

四、生物安全注意事项

 

1、操作要求：

 

在生物安全二级（BSL-2）实验室操作，穿戴防护装备（手套、口罩、实验服）。

 

废弃物需高压灭菌（121, 30分钟）。

 

2、耐药性监测：建议定期进行药敏试验。

 

通过上述步骤，可确保金黄色葡萄球菌的有效活化、稳定保存及准确鉴定。实验时需严格遵守生物安全规范，避免交叉污染和职业暴露。

 

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