如何避免在微生物实验中出现空白对照平板长菌的情况？

 

百欧博伟生物：在微生物实验中，避免空白对照平板长菌的核心是从源头控制污染，需结合培养基制备、无菌操作、环境管理等全流程进行规范。以下是具体的预防措施：

 

一、确保培养基及相关试剂的无菌性

 

1、严格灭菌参数

 

培养基（如营养琼脂、LB 培养基）需采用高压蒸汽灭菌：121、0.105MPa 条件下维持 15-20 分钟（含芽孢的样品需延长至 30 分钟），确保杀灭耐热微生物及芽孢。

 

分装培养基时，体积不超过容器的 1/2，避免灭菌时受热不均；分装后立即灭菌，不可长时间存放（尤其是富含营养的培养基，易滋生微生物）。

 

稀释液（如生理盐水、PBS）需单独灭菌，采用高压蒸汽灭菌或过滤灭菌（针对不耐热试剂），灭菌后密封储存，避免反复开盖使用。

 

2、验证灭菌效果

 

定期对灭菌后的培养基进行无菌性检测：取少量培养基接种到空白平板或液体培养基中，37培养 24-48 小时，观察是否长菌。

 

检查灭菌设备：定期校准灭菌器的温度、压力传感器，确保显示值与实际一致；灭菌前彻底排尽冷空气（如灭菌器排气阀打开至有连续蒸汽排出）。

 

二、规范无菌操作，减少人为污染

 

1、优化操作环境

 

所有操作（如倒平板、接种、开盖）需在超净工作台内进行，提前 30 分钟开启工作台通风，并用紫外灯照射 30 分钟消毒；定期检测 HEPA 滤网（每 3-6 个月），确保过滤效率（0.3μm 颗粒截留率≥99.97%）。

 

非工作台操作时（如运输平板），避免在尘埃多、人员密集的环境中暴露平板，减少气流扰动。

 

2、严格人员操作规范

 

实验前：用 75% 酒精擦拭双手、前臂及工作台面；穿戴无菌手套、口罩、实验服（袖口收紧），避免头发、皮肤暴露。

 

倒平板时：

 

三角瓶瓶口经酒精灯火焰灼烧灭菌（避免直接灼烧培养基），倾斜培养皿，仅打开 1/3-1/2 盖子，快速倒平板（约 15-20mL / 皿），立即盖紧盖子。

 

倒完后轻轻晃动平板，使培养基均匀铺展，待凝固后倒置（避免冷凝水滴落污染表面）。

 

平板处理：拿取培养皿时捏边缘，不触碰盖子内侧或培养基表面；避免在平板上方说话、咳嗽，头部偏离平板 10cm 以上。

 

3、确保器具无菌

 

培养皿、移液管、三角瓶等器具需经干热灭菌（160-170，2-3 小时）或高压蒸汽灭菌，灭菌后密封保存（如培养皿用无菌包装袋封装），使用前检查包装是否破损。

 

重复使用的器具（如移液管）需彻底清洗后再灭菌，避免残留有机物滋生微生物。

 

三、清洁与维护培养及储存环境

 

1、培养箱的日常管理

 

每周用 75% 酒精擦拭培养箱内壁、隔板及托盘，每月用含氯消毒剂（如 500mg/L 次氯酸钠）彻底消毒 1 次，清除残留微生物。

 

定期检查培养箱温度、湿度，避免积水（托盘及时倒水），防止霉菌滋生；培养时确保平板盖子盖紧，避免与其他污染平板直接接触。

 

2、储存环境控制

 

灭菌后的培养基（未倒平板）需在 4冰箱密封保存，存放时间不超过 1 周（避免冷凝水回流污染）；倒好的空白平板需倒置储存在无菌保鲜盒中，1-2 天内使用完毕。

 

实验台、冰箱等区域定期清洁，避免堆放杂物，减少微生物滋生的“死角”。

 

四、建立污染预警与追溯机制

 

1、设置多重对照

 

除空白平板（未接种样品）外，可增设“操作对照”（如仅倒平板、模拟接种操作但不加入样品），辅助判断污染来源（是培养基本身还是操作污染）。

 

2、记录与排查

 

详细记录实验日期、培养基批次、灭菌参数、操作人员、培养条件等信息，若出现污染可快速追溯环节（如同一批次培养基多组空白污染，优先排查灭菌问题）。

 

3、定期培训与考核

 

对实验人员进行无菌操作培训，重点强调倒平板、开盖、环境清洁等关键步骤；通过模拟实验考核操作规范性，减少人为失误。

 

通过以上措施，可从“灭菌彻底性、操作规范性、环境洁净度”三个维度降低污染风险，确保空白对照平板的无菌性，为实验结果的准确性提供保障。

 

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