培养基的制备和高压蒸汽灭菌的操作步骤与注意事项！

 

培养基的制备和高压蒸汽灭菌是微生物实验中至关重要的环节，直接影响实验结果的准确性和可靠性。以下将详细介绍这两个过程的操作步骤、注意事项及相关原理。

 

一、培养基的制备

 

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的营养基质，其制备需遵循无菌操作原则，确保营养成分比例适当、pH 值适宜。

 

1、制备流程

 

配方确定：根据培养目标微生物的营养需求选择合适配方（如细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌常用马铃薯葡萄糖培养基）。

 

称量与溶解：按配方准确称量各成分，加入适量蒸馏水（或去离子水），加热搅拌至完全溶解。

 

注：部分成分（如琼脂）需煮沸溶解，避免结块；难溶成分可单独溶解后再混合。

 

调节 pH 值：用 1mol/L HCl 或 NaOH 调整 pH 至目标值（如细菌通常为 7.2-7.4，真菌为 5.5-6.0），用 pH 计或精密试纸检测。

 

定容：将溶液转移至容量瓶中，加蒸馏水定容至所需体积，混合均匀。

 

分装：将培养基分装至锥形瓶、试管等容器中，装入量不宜过多（一般不超过容器容积的 1/2，避免灭菌时溢出），试管口需加棉塞或硅胶塞，锥形瓶需用纱布包裹瓶口后加盖。

 

2、注意事项

 

称量时避免交叉污染，专用天平及称量工具需清洁。

 

溶解过程中防止溶液蒸发导致浓度偏差，可加盖表面皿。

 

对热敏感的成分（如抗生素、维生素）需在灭菌后冷却至 50-60时加入（即“过滤除菌”后添加），避免高温破坏。

 

二、高压蒸汽灭菌

 

高压蒸汽灭菌是利用高温高压的饱和蒸汽杀灭包括芽孢在内的所有微生物的方法，适用于培养基、玻璃器皿、实验器械等的灭菌。

 

1、灭菌原理

 

在密闭的高压蒸汽灭菌锅中，蒸汽压力升高时，温度随之升高（如 103.4kPa 压力下，温度可达 121.3），能快速破坏微生物的蛋白质、核酸等结构，达到灭菌效果。

 

2、操作步骤

 

装锅：将分装好的培养基及待灭菌物品放入灭菌锅，注意摆放疏松，留有空隙，便于蒸汽流通；加水至水位线（避免干烧）。

 

排气：关闭排气阀，加热至沸腾，待锅内冷空气充分排出（一般当压力上升至 0.05MPa 时打开排气阀，放出冷空气至压力为 0，重复 1-2 次），确保锅内为纯饱和蒸汽。

 

升压与灭菌：关闭排气阀，继续加热至所需压力（常用 103.4kPa），维持该压力和温度（121.3），灭菌 20-30 分钟（根据物品调整：如培养基灭菌 20-30 分钟，玻璃器皿可延长至 30-60 分钟）。

 

降压与出锅：灭菌结束后，关闭热源，自然降压至 0MPa，打开排气阀放气，待压力完全释放后打开锅盖，取出物品。

 

注：严禁在压力未降至 0 时开盖，避免蒸汽喷溅导致烫伤。

 

灭菌后处理：培养基需趁热取出，如需制成斜面，可将试管倾斜放置至凝固；灭菌后的物品需检查是否灭菌合格（如培养基有无浑浊、棉塞是否潮湿）。

 

3、注意事项

 

灭菌锅使用前需检查安全阀、压力表是否正常，排水阀是否通畅，防止故障。

 

不同物品灭菌参数不同：如牛奶等液体需用“间歇灭菌”（避免沸腾溢出），而固体物品可按常规参数灭菌。

 

灭菌后物品需在无菌环境中存放，避免二次污染；培养基需倒置存放，防止冷凝水污染表面。

 

三、灭菌效果验证

 

物理监测：记录灭菌过程中的压力、温度及时间，确保符合标准。

 

化学监测：将灭菌指示卡放入灭菌物品中，灭菌后观察颜色是否达标。

 

生物监测：采用嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢（对热抵抗力强）作为指示菌，灭菌后培养观察是否存活，无生长则说明灭菌合格。

 

通过规范的培养基制备和高压蒸汽灭菌操作，可有效保障微生物实验的无菌环境，为实验成功奠定基础。

 

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