小鼠结肠粘膜上皮细胞培养过程中防止污染的操作规程！

 

小鼠结肠粘膜上皮细胞培养中，污染是导致实验失败的主要原因之一（尤其是原代培养，组织来源复杂且操作步骤多）。需从取材、试剂、操作、环境等全流程采取严格防控措施，具体如下：

 

一、取材阶段：源头控制污染

 

1、动物预处理

 

选择无特定病原体（SPF 级）小鼠，避免携带隐性感染（如肠道细菌、病毒）。处死前可通过饮水或腹腔注射抗生素（如青霉素）预处理 1-2 天，降低肠道内源性细菌负荷。

 

无菌取材操作：

 

小鼠处死后，用 75% 酒精全身擦拭消毒，在超净工作台内解剖，避免接触非无菌区域（如皮毛、工作台边缘）。

 

取出结肠后，立即放入预冷的含高浓度双抗的 PBS（青霉素 + 链霉素终浓度各 200 U/mL，常规浓度的 2-4 倍）中，反复冲洗肠腔至无粪便残留（粪便含大量细菌，是污染主要源头）。

 

剥离粘膜层时，若发现肠壁充血、化脓等异常，直接丢弃该组织，避免污染扩散。

 

2、组织处理的无菌性

 

所有接触组织的器械（剪刀、镊子、培养皿）需经高压灭菌或一次性无菌耗材，使用前用 75% 酒精擦拭并在酒精灯火焰旁冷却（避免高温损伤组织）。

 

粘膜组织剪碎后，可先用含抗生素的 PBS 浸泡 10 分钟，进一步减少表面污染。

 

二、试剂与耗材：确保无菌且无毒性

 

1、试剂制备与储存

 

所有试剂（培养基、酶、PBS、血清等）需严格无菌处理：

 

培养基、PBS 等通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌（避免高压灭菌破坏成分）；酶类（如胰蛋白酶、胶原酶）可分装后 - 20冻存，避免反复冻融导致活性下降和污染风险增加。

 

胎牛血清（FBS）需筛选批次，优先选择经无菌检测（如支原体、细菌）的产品，必要时可 56灭活 30 分钟（破坏补体，减少潜在污染，但可能降低生长因子活性，需权衡）。

 

试剂储存：避免在室温下久放，开封后的培养基 4保存不超过 2 周，添加生长因子的完全培养基建议 2-3 天内用完。

 

2、耗材选择与处理

 

选用无菌包装的一次性耗材（培养皿、离心管、移液枪头），开封前检查包装完整性，避免使用破损包装的耗材。

 

重复使用的器械（如剪刀、镊子）需彻底清洗后，高压蒸汽灭菌（121，30 分钟），冷却后在超净台内开封使用。

 

三、操作过程：严格无菌操作规范

 

1、超净工作台管理

 

操作前 30 分钟开启超净台紫外灯消毒，关闭后通风 10 分钟（避免紫外残留损伤细胞）；用 75% 酒精擦拭工作台面、移液器及手臂（戴无菌手套后）。

 

操作时，试剂瓶、培养皿等开口需朝向酒精灯火焰旁（形成无菌区），避免瓶口接触非无菌表面；移液时避免产生气泡（气泡破裂可能带入污染物）。

 

2、消化与离心环节

 

酶解体系需在无菌条件下配制，消化过程中每隔 5-10 分钟观察细胞状态，避免长时间暴露在超净台外。

 

离心时，离心管盖需拧紧，离心结束后用 75% 酒精擦拭管外壁再放入超净台，打开盖子时避免手指接触管口。

 

3、避免交叉污染

 

不同样本（如正常与病变组织细胞）需分开操作，更换样本时彻底消毒工作台和移液器，更换手套。

 

废弃液体（如消化废液）需倒入含消毒液（如 84 消毒液）的专用容器，废弃耗材（如污染的培养皿）需密封后按医疗废物处理。

 

四、培养环境：定期监测与维护

 

1、培养箱管理

 

每周用 75% 酒精擦拭培养箱内壁、隔板，定期更换培养箱内的水盘（使用无菌水，避免霉菌滋生）。

 

监测 CO浓度和温度：每日观察培养箱参数，若发现异常（如温度波动、CO泄漏），立即转移细胞至备用培养箱，排查故障。

 

2、细胞状态监测

 

每日镜检细胞：若发现培养基浑浊（细菌污染呈云雾状、pH 骤降变黄）、出现白色 / 黑色絮状物（真菌污染）或颗粒沉淀，立即判断污染类型并处理：

 

轻度污染（早期）：可尝试用高浓度双抗（如青霉素 + 链霉素各 500 U/mL）处理，但原代细胞对药物敏感，效果有限，建议优先丢弃。

 

严重污染：立即将污染培养皿密封，移出培养箱，避免污染扩散；彻底消毒培养箱及周边环境。

 

五、应急处理：污染扩散的防控

 

若发生大规模污染（如多个样本同时污染），需停止所有操作，排查污染源（如试剂、耗材、培养箱），对所有可能污染的物品彻底消毒或更换。

 

操作人员若接触污染样本，需立即用 75% 酒精消毒接触部位，避免实验室人员感染（尤其注意人畜共患病原菌）。

 

六、总结

 

防止污染的核心是“全程无菌 + 源头控制”：从动物取材的严格消毒，到试剂耗材的无菌验证，再到操作过程的规范细致，每一步都需谨慎。原代结肠上皮细胞本身脆弱，一旦污染很难挽救，因此“预防”比“处理”更重要，需建立标准化操作流程并严格执行。

 

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