如何在不影响培养基组分稳定性的前提下降低培养温度？

 

百欧博伟生物：在不影响培养基组分稳定性的前提下降低培养温度（如从常规 37降至 25-30，或从常温储存降至低温），核心是规避低温可能导致的组分物理/化学性质改变（如溶解度下降、分子聚集、冰晶损伤等），同时利用低温对多数化学反应的抑制作用（延长稳定性）。具体可通过调整配方、优化操作流程及添加保护剂实现，以下从关键策略和针对性措施展开说明。

 

一、核心原则：明确“低温风险”并针对性规避

 

降低培养温度可能引发的组分稳定性风险主要包括：

 

物理性风险：部分组分（如某些盐类、大分子）因低温溶解度下降导致沉淀；溶液结冰后局部浓度骤升引发组分聚集（如蛋白质、胶体）。

 

化学性风险：极少数物质（如特定酶、敏感抗生素）因低温破坏空间结构导致失活；长期低温（尤其冷冻）可能加速微量氧化（需氧气参与的反应虽减慢，但未完全停止）。

 

因此，措施需围绕“维持组分溶解状态”“保护分子结构”“抑制异常反应”设计。

 

二、关键策略及具体操作

 

（一）调整培养基配方：适配低温下的溶解与稳定需求

 

通过优化组分浓度、添加助溶剂或调整配比，避免低温导致的物理性不稳定（如沉淀、分层）。

 

1、降低低温敏感组分的初始浓度

 

针对低温下溶解度显著下降的物质（如某些无机盐、琼脂、大分子聚合物），适当降低浓度至“低温溶解度阈值以下”，避免析出。

 

示例：磷酸氢二钾在 20溶解度约 150g/L，10降至约 100g/L，若培养基需在 10下使用，可将其浓度从常规 1.5g/L 降至 1.0g/L（仍满足营养需求，且低于 10溶解度阈值）。

 

注意：需确保浓度调整后不影响培养基核心功能（如营养供给、渗透压、缓冲能力），可通过预实验验证（如检测细胞生长或微生物增殖效率）。

 

2、添加助溶剂或稳定剂，提升组分低温溶解性

 

对需维持较高浓度但低温易沉淀的组分（如氨基酸、维生素），添加助溶剂增加其在低温下的溶解稳定性。

 

常用助溶剂：

 

小分子有机物：甘油（5%-10%）、乙二醇（3%-5%）—— 通过降低溶液冰点、破坏晶体形成，提升盐类和小分子的溶解度（如甘油可使硫酸镁在 5的溶解度提升 20%-30%）。

 

表面活性剂：吐温 80（0.01%-0.1%）、聚山梨酯 —— 针对脂溶性组分（如维生素 A、胆固醇），减少低温下的聚集沉淀。

 

注意：助溶剂需低毒（如细胞培养中甘油浓度≤10%，避免影响细胞活性），且不与其他组分反应（如吐温 80 与青霉素兼容性良好，但需避免与阳离子聚合物混用）。

 

3、优化缓冲体系，维持低温下的 pH 稳定

 

低温可能影响缓冲剂的解离平衡（如磷酸盐在低温下缓冲能力略降），导致 pH 波动，间接引发组分（如蛋白质、氨基酸）稳定性下降。

 

调整方案：改用低温下缓冲能力更强的体系，如将“磷酸盐缓冲”替换为“HEPES 缓冲”（HEPES 在 10-40范围内缓冲能力稳定，而磷酸盐在＜20时缓冲效率下降约 15%）；或适当提高缓冲剂浓度。

 

（二）控制降温与储存流程：避免“骤变”导致的组分损伤

 

低温下的稳定性不仅依赖配方，还与降温速度、储存方式直接相关 ——缓慢降温 + 合理分装可减少局部浓度不均和冰晶损伤。

 

1、缓慢梯度降温，减少局部浓度波动

 

快速降温（如从 37直接放入 4冰箱）可能导致溶液中局部温度骤降，引发组分（如蛋白质、胶体）因“局部过饱和”而聚集。

 

操作建议：

 

降温速率控制在 0.5-1/min（如 37→25（静置 30 分钟）→15（静置 30 分钟）→4冷藏）。

 

对需冷冻（如 - 20）的培养基，先在 4预冷 1 小时，再转移至 - 20（避免直接冷冻导致冰晶过大）。

 

2、分装成小体积，避免反复冻融

 

低温储存的培养基若反复冻融（如从 - 20取出使用后再冷冻），会因冰晶反复形成 - 融化，破坏大分子结构（如血清蛋白、酶类），导致聚集沉淀。

 

操作建议：按单次使用量分装（如 100mL / 瓶，而非 500mL / 瓶），冻存后一次用完；若需多次使用，可在 4冷藏（而非冷冻），并缩短储存时间（如含血清培养基 4冷藏不超过 1 周）。

 

3、避免长期冷冻（尤其 - 80超低温），优先冷藏

 

多数组分在 4冷藏（而非 - 20冷冻）下更稳定（冷冻仅适用于需长期储存的场景）：

 

例：维生素 B12 在 4下可稳定 1 个月，-20冷冻 1 个月后活性下降 5%（因冰晶轻微破坏结构）；血清在 4冷藏 1 周无明显沉淀，-20冷冻 3 个月可能出现少量蛋白聚集。

 

例外：对热敏感且需长期保存的组分（如抗生素、生长因子），仍需冷冻，但需添加保护剂（如 5% 血清 + 10% 甘油）。

 

（三）添加保护剂：针对性保护易受低温损伤的组分

 

对低温敏感的关键组分（如蛋白质、酶、抗生素），添加保护剂可维持其空间结构稳定，避免失活或聚集。

 

1、蛋白质/酶类保护

 

低温可能导致蛋白质分子间疏水作用增强，引发聚集（如血清中的白蛋白、培养基中的蛋白酶），需添加“抗聚集剂”。

 

常用保护剂：

 

大分子稳定剂：牛血清白蛋白（BSA，0.1%-1%）、明胶（0.05%-0.2%）—— 通过竞争性结合疏水位点，减少目标蛋白聚集。

 

小分子稳定剂：蔗糖（1%-5%）、海藻糖（1%-3%）—— 通过形成氢键包裹蛋白质分子，维持其天然结构（海藻糖对低温下的酶活性保护效果比蔗糖高 30%）。

 

2、抗生素与维生素保护

 

部分抗生素（如青霉素）在低温下可能缓慢水解，水溶性维生素（如维生素 C）可能微量氧化，需添加“抗降解剂”。

 

抗生素保护：添加 β- 内酰胺酶抑制剂，抑制青霉素在低温下的水解（延长保质期至 1 个月以上）。

 

维生素保护：添加抗氧化剂，清除低温下缓慢产生的活性氧，减少维生素 C 氧化（4下稳定性可提升 2 倍）。

 

3、抗冻保护（针对冷冻场景）

 

若需在 - 20以下冷冻储存，需添加抗冻剂减少冰晶形成（冰晶会刺破细胞膜或破坏大分子结构）。

 

常用抗冻剂：甘油（5%-15%）、二甲基亚砜（DMSO，1%-5%）—— 通过降低冰点（如 10% 甘油可使溶液冰点降至 - 5），减少冰晶生成；对细胞培养基，DMSO 还能保护细胞，同时不影响培养基营养成分。

 

（四）使用前预处理：恢复组分均匀性与活性

 

降低温度后的培养基在使用前需适当处理，避免因低温导致的“暂时性不稳定”（如沉淀、分层）影响使用效果。

 

1、缓慢升温 + 轻柔混匀，溶解析出物

 

若低温储存后出现少量沉淀（如盐类结晶），不可直接加热煮沸（可能破坏热敏感组分），应：

 

室温（25）静置 1-2 小时，或 40水浴缓慢加热（温度不超过 40），同时轻柔摇晃（避免剧烈搅拌导致泡沫，泡沫中的氧气可能加速氧化）。

 

若沉淀未溶解，需过滤（0.22μm 滤膜）去除（避免沉淀影响细胞或微生物生长），并检测关键组分浓度（确保未因沉淀导致营养缺失）。

 

2、补充易降解组分，恢复功能

 

若低温储存时间较长（如 4冷藏超过 2 周），部分易降解组分（如谷氨酰胺、维生素 B1）可能微量损失，可在使用前补充新鲜储备液（如谷氨酰胺按 0.2mmol/L 补加，无需调整整体配方）。

 

三、不同场景的针对性方案

 

应用场景   核心需求    关键措施

 

细胞培养（从 37降至 30） 维持血清、生长因子稳定 添加 0.1% BSA+5% 甘油；分装小瓶避免反复使用；使用前 30预热并混匀

 

微生物培养基（常温→10储存） 防止盐类沉淀、琼脂分层 降低磷酸钠浓度至 1.0g/L 以下；添加 0.05% 吐温 80；4预冷后再移至 10

 

含抗生素培养基（冷藏保存） 延长抗生素活性 添加 0.01g/L 克拉维酸钾；4冷藏不超过 1 周；使用前检测抑菌效果（如平板法）

 

冷冻储存（-20，长期保存） 避免蛋白聚集、冰晶损伤 10% 甘油 + 1% 蔗糖；分装 50mL 小瓶；缓慢降温（4→-20，间隔 2 小时）

 

四、验证与监测：确保组分稳定性未受影响

 

降低温度后，需通过以下方法验证组分稳定性，避免“隐性损伤”（如活性下降但无外观变化）：

 

物理指标：观察是否有沉淀、分层、颜色变化（如维生素 C 氧化会变褐）；检测 pH（应与原温度下差异≤0.3）和渗透压（波动≤5%）。

 

化学指标：通过高效液相色谱（HPLC）检测关键组分浓度（如葡萄糖、谷氨酰胺），确保损失率＜10%；检测抗生素效价（如抑菌圈实验）。

 

功能指标：通过目标应用验证（如细胞培养需检测细胞存活率、增殖速率；微生物培养基需检测菌落数）。

 

五、总结

 

在不影响培养基组分稳定性的前提下降低温度，需结合“配方优化（适配低温溶解）+ 流程控制（避免骤变损伤）+ 保护剂添加（维持分子结构）”，核心是让组分在低温下仍处于“溶解、分散、结构完整”的状态。同时，需根据具体组分特性和应用场景（短期冷藏/长期冷冻、细胞/微生物培养）调整方案，并通过验证确保功能未受影响。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！