马铃薯葡萄糖半固体琼脂培养基的灭菌方法及操作步骤！

 

马铃薯葡萄糖半固体琼脂培养基的灭菌是保证其无菌性、避免杂菌污染的关键步骤，通常采用高压蒸汽灭菌法，具体操作方法及注意事项如下：

 

一、核心灭菌方法：高压蒸汽灭菌法

 

（一）原理

 

利用高压蒸汽产生的高温（121左右）杀灭培养基中可能存在的细菌、真菌、芽孢等所有微生物，同时不破坏培养基中的营养成分（如葡萄糖、马铃薯浸出物中的有效成分）。

 

（二）具体操作步骤

 

1、分装后密封

 

将制备好的培养基（已溶解、调 pH、分装至试管或锥形瓶）装入容器，试管需加棉塞（或硅胶塞）并包扎，锥形瓶需加盖或用纱布包裹瓶口，确保既透气（灭菌时排出冷空气）又能防止灭菌后污染。

 

2、放入高压蒸汽灭菌锅

 

将容器垂直放入灭菌锅的灭菌篮中，避免倾倒；

 

注意不要装得太满，留出蒸汽流通空间，保证灭菌均匀。

 

3、设定灭菌参数

 

温度：121

 

压力：0.103-0.138MPa（对应标准大气压下的饱和蒸汽压力）

 

时间：15-20 分钟（时间过短可能灭菌不彻底，过长可能破坏营养成分）。

 

4、排气与灭菌

 

先打开排气阀，加热至产生大量蒸汽，排出锅内冷空气（冷空气会导致温度不达设定值，影响灭菌效果），待排气阀持续排出白色蒸汽（约 3-5 分钟）后，关闭排气阀；

 

当压力和温度升至设定值时，开始计时，保持参数稳定至灭菌结束。

 

5、降压与取出

 

灭菌结束后，关闭热源，自然降压至 0MPa（切勿强行打开排气阀，避免培养基暴沸溢出）；

 

打开灭菌锅盖，取出培养基，待其冷却（如需凝固成半固体状态，可将试管倾斜放置，形成 “斜面” 或水平凝固）。

 

二、灭菌注意事项

 

1、彻底排气

 

灭菌锅冷空气未排净会导致 “假压”（压力达标但温度不足），可能造成灭菌不彻底，需确保排气充分。

 

2、避免过度灭菌

 

葡萄糖在高温下易分解产生有害物质（如 5 - 羟甲基糠醛），且马铃薯浸出物中的维生素也可能被破坏，因此严格控制灭菌时间（不超过 20 分钟）。

 

3、分装量适中

 

容器内培养基不宜超过容积的 2/3，防止灭菌时因蒸汽膨胀溢出。

 

4、灭菌后检查

 

观察培养基是否澄清（半固体状态下允许少量马铃薯成分的沉淀，摇匀后不影响使用）；

 

若发现培养基浑浊、有絮状物或异味，可能灭菌失败或已污染，需重新制备。

 

5、灭菌锅维护

 

定期检查灭菌锅的压力阀、密封圈等部件，确保设备正常运行，避免安全隐患。

 

三、为何不采用其他灭菌方法？

 

干热灭菌：温度需 160-170、2-3 小时，会严重破坏培养基中的营养成分，不适用。

 

煮沸灭菌：温度仅 100，无法杀灭芽孢，灭菌不彻底。

 

过滤灭菌：适用于不耐高温的液体，但琼脂需加热溶解，且培养基为半固体状态，无法过滤。

 

因此，高压蒸汽灭菌（121、15-20 分钟）是马铃薯葡萄糖半固体琼脂培养基的最优灭菌方式，既能保证无菌，又能最大程度保留营养。

 

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