乳酸菌检验计数方法的分类与操作流程及结果判读规则！

 

百欧博伟生物：乳酸菌检验的计数是评估发酵食品（如酸奶、泡菜）、益生菌制剂等样品中乳酸菌活菌数量的核心步骤，需严格遵循操作规范以保证结果准确性。以下从计数方法分类、操作流程、结果判读规则及注意事项进行详解。

 

一、计数方法分类及适用场景

 

乳酸菌计数的核心是活菌培养计数法（基于“一个活菌形成一个菌落”的原理），根据样品中菌含量高低，分为以下两种常用方法：

 

1、平板涂布法（适用于菌含量中等的样品）

 

原理：将稀释后的样品均匀涂布在固体培养基表面，培养后计数菌落，推算原始样品中的活菌数。

 

优势：操作简单，菌落分布均匀，计数误差小；

 

适用场景：酸奶、发酵乳等菌含量在 10-10 CFU/g（mL）的样品。

 

2、倾注平板法（适用于菌含量较低的样品）

 

原理：将稀释后的样品与冷却至 45-50的液态培养基混合，倒入平板，凝固后培养，菌落均匀生长在培养基内部或表面。

 

优势：能捕获更多活菌（尤其对部分厌氧性较强的乳酸菌），适用于低菌含量样品；

 

不足：菌落可能重叠（内部菌落不易观察），计数时需注意区分；

 

适用场景：益生菌片剂（需研磨溶解）、发酵初期样品等菌含量＜10 CFU/g（mL）的样品。

 

二、核心操作流程（以平板涂布法为例）

 

1、样品稀释（关键步骤：避免稀释误差）

 

稀释液选择：使用0.85% 无菌生理盐水或磷酸缓冲盐溶液（PBS），避免渗透压对乳酸菌的损伤（乳酸菌为革兰氏阳性菌，对渗透压敏感）。

 

稀释梯度设计：

 

根据样品预期菌含量确定稀释倍数：例如酸奶中乳酸菌含量通常为 10-10 CFU/mL，需稀释至 10、10、10梯度；

 

操作要求：

 

按“1mL 样品 + 9mL 稀释液”进行10 倍系列稀释（如 10¹→10²→…→10），每梯度更换无菌移液枪头；

 

稀释时需充分振荡（用涡旋混合器或手搓试管 10-15 秒），确保菌液均匀分散，避免成团乳酸菌未散开导致计数偏低。

 

2、培养基选择（需满足乳酸菌生长特性）

 

核心要求：乳酸菌为兼性厌氧或微需氧菌，且多数为革兰氏阳性、不产芽孢，需选择选择性培养基抑制杂菌（如大肠菌群、酵母菌）。

 

常用培养基：

 

MRS 培养基：最常用，营养丰富（含酵母浸粉、葡萄糖、吐温 - 80），能促进绝大多数乳酸菌（乳杆菌、链球菌等）生长；

 

改良 MC 培养基（适用于双歧杆菌计数，需添加半胱氨酸作为还原剂）。

 

3、接种与培养（控制厌氧环境）

 

接种量：选择2-3 个连续稀释梯度（确保每个平板菌落数在 30-300 CFU 之间，此范围为计数有效区间），每个梯度做2-3 个平行平板，每平板接种 0.1mL 稀释液（涂布法）或 1mL（倾注法）。

 

涂布操作：用无菌 L 型玻璃棒（提前在酒精灯上灼烧灭菌，冷却后使用）将 0.1mL 样品均匀涂布在培养基表面，待液体吸收后倒置培养。

 

培养条件：

 

温度：36±1（乳酸菌最适生长温度）；

 

厌氧环境：用厌氧培养盒（放入厌氧袋，产生 H和 CO，去除 O）或厌氧培养箱，培养时间 48±2 小时（确保菌落充分生长）。

 

4、菌落计数与结果计算

 

菌落形态识别：乳酸菌在 MRS 培养基上的典型菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色或浅灰白色，直径 0.5-2mm（不同菌株略有差异）；需排除杂菌（如酵母菌菌落较大、边缘不整，霉菌有菌丝）。

 

计数规则：

 

选择菌落数在30-300 CFU的平板计数（低于 30 为“太少，误差大”，高于 300 为“太多，菌落重叠”）；

 

若同一稀释梯度的平行平板菌落数差值≤1 倍（如 100 和 150 CFU），取平均值；若差值＞1 倍，需重新实验；

 

若所有平板菌落数均＜30 CFU，以最低稀释度的平均菌落数计算（需注明 “＜XX CFU/g”）；若均＞300 CFU，以最高稀释度计算。

 

结果计算公式：

 

活菌数（CFU/g 或 mL）= 平均菌落数 × 稀释倍数 × 1 / 接种量（涂布法接种 0.1mL 时，×10；倾注法接种 1mL 时，×1）

 

例：10稀释度的平板平均菌落数为 150 CFU，接种 0.1mL，则：

 

活菌数 = 150 × 10 × 10 = 1.5×10¹ CFU/mL。

 

三、关键规则与结果判读标准

 

1、有效计数区间：

 

仅统计菌落数在 30-300 CFU 的平板，若同一稀释梯度的平板中部分在区间内、部分超出，仅用区间内平板计算（如 10梯度 2 个平板分别为 280 和 320 CFU，取 280 计算）。

 

2、稀释梯度选择：

 

需覆盖“菌落数从少到多”的连续梯度，例如样品预期菌含量高时，需稀释至 10甚至 10，避免所有平板菌落数均＞300。

 

3、杂菌排除规则：

 

若杂菌数≤10%（相对于乳酸菌菌落数），可忽略；

 

若杂菌数＞10%，需重新检测（可能是样品污染或培养基失效）；

 

疑难菌落需通过革兰氏染色（乳酸菌为革兰氏阳性、无芽孢）或生化试验（如发酵葡萄糖产酸）确认。

 

4、结果报告要求：

 

以“CFU/g”或“CFU/mL”为单位，保留两位有效数字（如 2.5×10 CFU/g）；

 

若菌落数＜30 CFU / 平板，报告为“＜XX CFU/g”（如＜3.0×10 CFU/g）；

 

注明检测方法（如“MRS 培养基，平板涂布法”）和培养条件。

 

四、注意事项（减少误差与污染）

 

1、无菌操作：

 

稀释液、培养基需高压灭菌（121，15 分钟）；

 

操作在超净工作台进行，避免环境杂菌污染（如手接触样品、平板开盖时间过长）。

 

2、稀释准确性：

 

移液枪需定期校准，确保移液体积准确；

 

稀释时每梯度充分振荡（尤其样品含颗粒时，如泡菜需均质后稀释）。

 

3、厌氧环境控制：

 

厌氧袋需在有效期内使用（包装破损或过期会导致厌氧失败）；

 

培养前检查厌氧盒密封性，避免 O进入抑制乳酸菌生长。

 

4、菌落识别训练：

 

新手需通过已知标准菌株（如保加利亚乳杆菌）的菌落形态对比，避免误将杂菌计入。

 

五、总结

 

乳酸菌计数的核心是“稀释准确→培养规范→计数有效”：通过梯度稀释控制菌落数在 30-300 CFU 区间，用 MRS 培养基和厌氧条件选择性培养，结合菌落形态排除杂菌，最终以平行平板的平均值计算活菌数。严格遵循操作规则可减少误差，确保结果能真实反映样品中乳酸菌的活性（活菌数是评估发酵食品品质和益生菌有效性的关键指标）。

 

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