菌种保藏过程中避免杂菌污染是保证保藏效果的核心前提！

 

百欧博伟生物：在菌种保藏过程中，避免杂菌污染是保证保藏效果的核心前提之一（污染会导致目标菌株被取代或性状干扰）。污染可能来自操作环境、实验器具、操作人员、原始菌株本身等，需通过“全流程防控”实现无菌化，具体措施可分为以下几个关键环节：

 

一、保藏前：确保原始菌株“纯净”且操作环境无菌

 

1、原始菌株的纯化与验证

 

保藏的菌株必须是单一纯种，保藏前需通过平板划线、稀释涂布等方法纯化，观察菌落形态是否均一（如大小、颜色、边缘、质地等无杂菌特征）。

 

必要时结合显微镜观察（如细菌的形态、真菌的孢子结构）或生理生化实验（如特定培养基上的生长特性），确认无杂菌后再进行保藏。

 

例：若保藏酵母菌，需排除细菌污染 —— 可在加有抗生素（如青霉素）的培养基上培养，细菌无法生长而酵母菌存活。

 

2、操作环境的无菌控制

 

核心操作需在超净工作台（生物安全柜） 内进行，提前 30 分钟开启紫外灯消毒（15-30 分钟），并通风去除臭氧。

 

定期清洁超净台内部（用 75% 酒精擦拭台面、侧壁），避免残留污染物；工作台外环境需保持整洁，减少空气扬尘。

 

若进行冷冻干燥、液氮保藏等复杂操作，需在无菌室中进行，定期监测环境菌落数（如沉降菌检测）。

 

3、实验器具与试剂的无菌处理

 

玻璃器皿（试管、培养皿、移液管）、金属工具（接种环、镊子）需干热灭菌（160-180，2-3 小时）或高压蒸汽灭菌（121，15-30 分钟），灭菌后妥善存放（如灭菌后的试管塞需避免接触非无菌表面）。

 

液体试剂（如培养基、甘油溶液、冷冻保护剂）需高压蒸汽灭菌；固体培养基灭菌后需倒平板，待凝固后检查是否有污染（如无杂菌菌落）。

 

特殊试剂（如用于冷冻干燥的保护剂）若无法高温灭菌，需通过滤膜过滤（0.22μm 孔径）除菌。

 

二、保藏操作中：严格无菌操作，避免交叉污染

 

1、操作人员的无菌规范

 

操作前需洗手并消毒（75% 酒精擦拭），穿戴无菌手套、口罩、实验服，避免手部、呼吸产生的微生物污染。

 

接种工具（接种环、移液管）使用前需灼烧灭菌（接种环在酒精灯火焰上烧至红热，冷却后使用，避免烫死目标菌株），每处理一个菌株后需重新灭菌，严禁交叉使用。

 

2、菌株转移与分装的无菌性

 

转移菌株时（如从斜面接种到甘油管），试管口需在酒精灯火焰附近操作（形成无菌区），开塞后试管口快速过火焰灭菌，避免空气杂菌进入。

 

分装保藏容器（如冷冻管、冻干安瓿瓶）时，需确保容器已灭菌，且分装过程中开口时间尽量缩短，避免暴露于空气中过久。

 

若保藏多个菌株，需标记清晰（菌株名称、编号、保藏日期），并分开操作，避免容器混淆或液体溅洒导致交叉污染。

 

3、不同保藏方法的针对性防护

 

冷冻干燥保藏：安瓿瓶封口前需确保内部为真空状态，封口时火焰灼烧密封，避免漏气导致杂菌侵入。

 

液氮保藏：液氮罐需定期清洁，避免罐内残留的水或污染物进入保藏管；保藏管需使用耐低温、密封良好的专用容器（如螺旋盖冷冻管），防止液氮渗入或管内菌株泄漏。

 

斜面保藏：接种后斜面需直立培养至菌落长出，确认无杂菌后再放入 4冰箱，冰箱内避免存放易污染的物品（如未密封的培养基）。

 

三、保藏后：储存环境维护与定期监测

 

1、储存环境的清洁与稳定

 

冰箱、液氮罐、冻干管储存盒等需定期清洁消毒（如冰箱内壁用 75% 酒精擦拭，液氮罐定期更换液氮并清理底部杂质）。

 

不同类型菌株（如致病菌、普通菌株）需分开储存，避免交叉污染风险；保藏区域需干燥、避光，减少环境微生物滋生。

 

2、定期检查与复苏验证

 

即使长期保藏，也需定期检查保藏容器是否破损、密封是否完好（如冷冻管是否开裂、安瓿瓶是否漏气），及时淘汰可疑容器。

 

对保藏菌株进行定期复苏（如每 1-2 年）：将菌株接种到新鲜培养基，观察生长状态和菌落纯度，若发现杂菌，需重新纯化后再次保藏。

 

复苏后的菌株需再次验证遗传性状（如代谢产物合成能力、形态特征），确保未因污染或变异改变特性。

 

四、总结：核心原则

 

菌种保藏防污染的关键是“源头控制（菌株纯、器具净）+ 过程无菌（操作规范）+ 环境稳定（储存安全）”。任何环节的疏忽都可能导致污染，因此需严格遵循无菌操作流程，尤其注意 “一人一菌一工具”（避免交叉）和“全程无菌区操作”（减少环境杂菌接触）。对于珍贵菌株，建议采用“多方法备份保藏”（如同时冷冻干燥和液氮保藏），进一步降低污染或丢失风险。

 

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