食品志贺氏菌检验方法详解之样品制备与增菌及生化鉴定！

 

食品中志贺氏菌（Shigella spp.）的检验是食品安全检测的重要项目之一，因为志贺氏菌是引起细菌性痢疾的主要病原体。目前国际上和国内主要采用的标准方法是基于选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清学分型的传统培养方法，并结合了现代分子生物学技术进行确证。

 

以下是最常用的检验方法概述，主要参考中国国家标准和国际标准：

 

核心方法：选择性增菌培养 + 分离培养 + 生化鉴定 + 血清学分型

 

一、样品制备与增菌

 

1、样品处理：

 

无菌操作称取25g（或25mL）食品样品。

 

放入灭菌的均质袋或均质瓶中。

 

加入225mL 志贺氏菌增菌肉汤或其他推荐的非选择性肉汤。这是前增菌步骤，目的是让受损的志贺氏菌细胞复苏并开始生长，同时稀释食品基质中的抑制物。

 

充分均质（拍打或搅拌）。

 

2、选择性增菌：

 

将均质液在36±1°C下培养16-20小时（前增菌）。

 

取1mL前增菌培养物，转种到10mL 志贺氏菌增菌肉汤（含新生霉素或其他选择性试剂） 或 革兰氏阴性杆菌增菌肉汤中。

 

在42±1°C（或36±1°C，视具体标准或增菌液要求而定）下培养18-24小时。此步骤利用温度或选择性抑制剂抑制杂菌（尤其是变形杆菌和大肠菌群），促进志贺氏菌生长。

 

二、分离培养（平板划线）

 

1、接种选择性平板：

 

用接种环取选择性增菌培养物，分别在以下两种（或更多）选择性/鉴别性琼脂平板上划线分离：

 

木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂：志贺氏菌通常呈现红色、半透明、光滑、中心不显黑色的菌落（不发酵木糖，不产HS）。是分离志贺氏菌的首选平板之一。

 

麦康凯琼脂：志贺氏菌呈现无色（不发酵乳糖）、半透明、光滑的菌落。

 

赫克通肠道菌琼脂/沙门氏菌-志贺氏菌琼脂：志贺氏菌落通常为绿色、半透明（不发酵乳糖，不产HS）。SS对志贺氏菌有一定抑制作用，有时效果不如XLD和MAC。

 

志贺氏菌显色琼脂：利用特异性酶底物显色，志贺氏菌通常呈现特定颜色（如紫色、蓝绿色等，具体颜色取决于品牌配方），能有效区分志贺氏菌和其他肠道菌，特异性较高。

 

2、培养：

 

将平板倒置于36±1°C培养20-24小时。

 

3、菌落挑选：

 

观察平板，挑取符合志贺氏菌典型形态特征的菌落（如XLD上的红色半透明菌落，MAC上的无色菌落，显色平板上的特定颜色菌落）。

 

每个平板至少挑选2-5个可疑菌落。

 

三、初步生化鉴定（纯培养与基本试验）

 

1、纯培养：

 

将挑选的可疑菌落分别接种到营养琼脂斜面或三糖铁琼脂（TSI） 和 赖氨酸铁琼脂（LIA） 上，以获得纯培养物用于后续试验。

 

36±1°C培养18-24小时。

 

2、关键生化试验（筛选试验）：

 

三糖铁琼脂（TSI）：志贺氏菌通常表现为：斜面碱性（红色）/底层酸性（黄色），不产气（琼脂不开裂或仅有小裂缝），不产HS（不显黑色）。这是与沙门氏菌（通常产HS）和部分变形杆菌区分的重要指标。

 

赖氨酸脱羧酶试验（LIA或单独试验）：志贺氏菌通常为阴性（斜面碱性/底层酸性，不显紫色）。有助于与部分沙门氏菌（阳性）区分。

 

动力试验（半固体培养基）：志贺氏菌无鞭毛，无动力（仅在穿刺线生长，周围培养基澄清）。这是与有动力的肠杆菌科细菌（如大肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）区分的关键特征。

 

尿素酶试验：志贺氏菌通常为阴性（不变红）。用于排除快速尿素酶阳性的细菌（如变形杆菌属）。

 

吲哚试验：结果可变，不同种/型结果不同（宋内氏志贺氏菌通常阳性，福氏志贺氏菌多为阴性）。

 

ONPG试验（β-半乳糖苷酶）：用于检测迟发酵乳糖的能力。宋内氏志贺氏菌通常为阳性（黄色），其他志贺氏菌为阴性（无色）。是区分宋内氏与其他志贺氏菌的重要试验。

 

四、血清学分型（确证）

 

1、前提：

 

生化反应符合志贺氏菌属特征（无动力、TSI斜面碱/底层酸不产气不产HS、赖氨酸脱羧酶阴性、尿素酶阴性）。

 

2、玻片凝集试验：

 

用生理盐水制备纯培养菌悬液。

 

先用志贺氏菌多价血清进行凝集试验。若阳性，则表明该菌株属于志贺氏菌属。

 

若多价血清凝集阳性，则进一步用志贺氏菌单价因子血清进行分群（A群：痢疾志贺氏菌；B群：福氏志贺氏菌；C群：鲍氏志贺氏菌；D群：宋内氏志贺氏菌）和分型/亚型。

 

注意：宋内氏志贺氏菌通常表现为光滑型（S）菌落，其血清凝集性较好。其他志贺氏菌（特别是福氏志贺氏菌）有时会出现粗糙型（R）变异，导致自凝或不凝集，此时需要传代恢复其光滑型或采用其他方法（如分子方法）确认。

 

自凝检查：菌悬液在生理盐水中应均匀混浊，无自凝现象。若有自凝，则血清凝集结果不可靠。

 

五、分子生物学确证（可选/补充）

 

PCR检测：针对志贺氏菌属特异性基因或种/型特异性基因进行PCR扩增。ipaH基因是常用的靶标，它存在于志贺氏菌和侵袭性大肠杆菌（EIEC）的染色体和毒力质粒上，拷贝数多，灵敏度高，特别适合从增菌液或可疑菌落中快速筛查和确证。

 

实时荧光定量PCR（qPCR）：更快速、灵敏，可用于定量或直接检测样品/增菌液。

 

优点：快速（数小时）、特异性高，尤其适用于生化反应不典型或血清学凝集不佳的菌株的确证，以及从复杂背景中直接检测。

 

注意：PCR阳性结果通常需要结合培养结果来判断活菌存在，并且不能替代血清学分型。

 

六、报告结果

 

根据生化鉴定和血清学分型结果，报告样品中是否检出志贺氏菌。

 

若检出，应报告其血清群和血清型（如福氏志贺氏菌2a型、宋内氏志贺氏菌等）。

 

若使用了分子方法确证，也应注明。

 

重要注意事项：

 

生物安全：志贺氏菌属于生物安全三级病原体！所有实验操作必须在具备相应生物安全防护条件的实验室（II级或III级生物安全柜）中进行，操作人员需经过严格培训并遵守生物安全规范。废弃物必须高压灭菌处理。

 

质控：每批实验必须包含阳性质控菌株（如福氏志贺氏菌ATCC 12022，宋内氏志贺氏菌ATCC 25931）和阴性质控（如大肠杆菌ATCC 25922）以确保培养基和试剂的有效性及操作的正确性。

 

志贺氏菌的脆弱性：志贺氏菌对干燥、酸和低温敏感，样品处理和运输需及时、低温（通常0-4°C，但不宜冷冻）。

 

与EIEC的区分：侵袭性大肠杆菌（EIEC）在生化特性、致病机制和临床症状上与志贺氏菌非常相似，血清学也可能有交叉。最终区分通常需要依赖毒力基因检测或更复杂的生化组合试验（如乙酸钠利用、粘液酸发酵等）。

 

方法的局限性：传统培养法耗时较长（通常需要4-5天或更长）。食品基质复杂，存在背景菌群竞争和抑制物，可能导致假阴性。分子方法虽快，但可能检出死菌或无法提供活菌信息及血清型。

 

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