细胞实验中PBS缓冲液的主要用途与使用方法及注意事项！

 

百欧博伟生物：细胞实验中PBS缓冲液的使用非常频繁和基础，正确使用是保证实验结果可靠性的关键。以下是详细的使用方法和注意事项：

 

一、PBS缓冲液的主要用途（在细胞实验中）

 

1、清洗细胞：移除培养基、血清、胰酶、细胞碎片、代谢废物或未结合的试剂（如抗体、染料）。

 

2、稀释试剂：稀释抗体、染料、酶、或其他需要维持生理pH和渗透压的试剂用于细胞实验。

 

3、配制溶液：作为基础缓冲液配制其他细胞处理液或染色液。

 

4、短暂浸泡/平衡：在换液、消化、固定等步骤之间，保持细胞处于生理渗透压环境中，防止细胞破裂或皱缩。

 

5、制备单细胞悬液：在细胞消化后，加入PBS稀释或终止消化，并用于重悬细胞。

 

6、作为阴性对照：在免疫染色、流式细胞术等实验中，替代一抗或二抗作为阴性对照。

 

二、PBS缓冲液的使用方法

 

1、解冻/预热：

 

冷藏的PBS：从4°C冰箱取出后，建议在室温下放置一段时间（或37°C水浴短暂预热），使其接近室温或37°C（根据实验要求）。绝对避免将冰冷的PBS直接加到贴壁细胞上！温度骤变会严重损伤甚至杀死细胞（热/冷休克）。

 

冷冻的PBS：使用前在4°C冰箱缓慢解冻过夜，或室温/37°C水浴快速解冻，解冻后需混匀（防止浓度梯度）。同样注意使用前达到适宜温度。

 

2、无菌操作：

 

在超净台或生物安全柜内进行所有涉及开放容器的操作。

 

打开瓶盖前，用75%酒精喷洒或擦拭瓶身和瓶口。

 

倾倒时避免瓶口接触任何非无菌物品（如培养皿边缘、移液管尖）。

 

使用无菌移液管或移液器及无菌枪头吸取。

 

3、清洗细胞：

 

吸弃原液：小心吸弃培养皿/培养瓶中的旧培养基或处理液，避免吸到细胞（尤其贴壁细胞）。

 

加入PBS：沿侧壁或中央（根据容器和细胞贴壁情况）轻柔加入适量预温的PBS（通常覆盖细胞层即可，例如6孔板每孔加1-2ml）。

 

轻柔摇晃：水平轻轻晃动培养皿/瓶数次，使PBS充分接触细胞表面。

 

吸弃PBS：小心吸弃PBS。对于需要彻底清洗的实验（如免疫染色），可重复此步骤2-3次。

 

关键点：动作要轻柔，避免液体直接冲击细胞层，防止细胞脱落。每次清洗后尽量吸干净残留液体。

 

4、稀释/配制试剂：根据实验方案要求，用PBS将所需试剂稀释到工作浓度。确保充分混匀。

 

5、短暂浸泡/平衡：在操作间隙（如消化后加培养基前），加入适量PBS覆盖细胞，短暂放置（通常几十秒到几分钟），然后吸弃。

 

6、重悬细胞：消化后的细胞沉淀，加入适量PBS，用移液管轻柔吹打（避免产生气泡）形成单细胞悬液。

 

三、至关重要的注意事项

 

1、无菌性：

 

核心原则：PBS本身没有防腐剂，极易滋生细菌。所有直接接触细胞的PBS必须是无菌的！

 

购买：购买商业化的无菌PBS（瓶装或袋装）。

 

自配：若自行配制，必须使用高纯度水，溶解试剂后，必须用0.22μm孔径的滤膜进行过滤除菌，并在无菌条件下分装。

 

分装：将大瓶PBS分装到小无菌瓶中/管中使用，避免大瓶反复开启增加污染风险。

 

有效期：开封后或自配的PBS应尽快使用。通常建议：

 

开封后置于4°C：1-2周内使用完。

 

未开封（商业无菌品）：按说明书标注的有效期。

 

观察：使用前务必检查PBS是否澄清透明、无沉淀、无浑浊、无絮状物。如有任何异常（即使未到有效期），绝对禁止使用！立即丢弃。

 

标识：清晰标注配制/开封日期和有效期。

 

2、渗透压与pH：

 

标准PBS：其渗透压（约290 mOsm/kg）和pH（7.2-7.4）是模拟生理环境设计的。

 

避免随意修改：除非特殊实验要求（如特定离子浓度的研究），否则不要自行添加其他盐类或改变浓度，这会改变渗透压，导致细胞胀破或皱缩。

 

pH监测：自配PBS或长期存放后使用前，建议用pH计检测pH值，确保在7.2-7.4范围内（特别是用于敏感细胞或长时间接触时）。空气中的CO溶解可能导致pH略微下降。

 

3、不含钙镁离子：

 

标准PBS：通常不含Ca²和Mg²（称为DPBS或PBS (-)）。

 

为什么重要？钙镁离子是细胞间粘附和细胞与底物粘附的重要因子。在消化细胞（如用胰酶）时，必须使用无钙镁的PBS进行清洗，否则残留的钙镁离子会抑制胰酶活性，导致消化不完全。在不需要细胞粘附的步骤（如清洗掉未结合抗体）中，使用无钙镁PBS也更为常用。

 

特殊需求：如果实验需要维持细胞粘附（如在某些处理过程中），应使用含钙镁的PBS（称为PBS (+)或CMF-PBS）。务必确认你使用的PBS类型是否符合实验要求！

 

4、温度控制：

 

致命点：绝对禁止将冷藏（4°C）的PBS直接加到贴壁细胞上！温度急剧变化会引起细胞膜损伤，导致大量细胞死亡、脱落。这是新手常犯的错误。

 

操作：使用前将PBS平衡至室温或37°C（根据细胞培养温度）。可将瓶子握在手中温热，或在37°C水浴或培养箱中短暂放置（注意避免污染瓶口）。接触细胞时，PBS温度应接近细胞培养温度。

 

5、轻柔操作：

 

加液、吸液、摇晃都要非常轻柔，避免液体产生湍流直接冲击细胞层，尤其在清洗贴壁细胞时。

 

使用移液器吹打细胞悬液时，避免产生大量气泡，气泡破裂产生的剪切力会损伤细胞。

 

6、不能替代培养基：

 

PBS 不含有 细胞生长所需的营养物质（氨基酸、维生素、葡萄糖等）和生长因子。细胞不能在PBS中长期存活！PBS仅用于短时间的清洗、稀释或平衡操作（通常几分钟内完成）。操作完成后，需要及时加入含有营养成分的完全培养基或其他处理液。

 

7、金属离子污染：

 

某些细胞类型对金属离子非常敏感。使用高纯度试剂和水配制PBS。避免使用金属容器盛放或搅拌。

 

8、废弃处理：

 

接触过细胞的PBS可能含有生物活性物质或潜在病原体，必须按照实验室生物安全规定进行处理，通常需要加入消毒剂浸泡消毒后再排放，或作为生物废液收集高压灭菌。

 

总结关键点口诀：

 

无菌是前提！（购买/过滤、分装、检查、标识）

 

温度要适宜！（严禁冰PBS直接浇细胞！室温/37°C预热）

 

钙镁看需求！（消化清洗用无钙镁（-），维持粘附用有钙镁（+））

 

操作需轻柔！（避免冲击细胞）

 

PBS非养料！（短时操作，及时换液）

 

废弃按规矩！（生物安全处理）

 

严格遵循这些使用方法和注意事项，能有效保证你的细胞健康，提高实验结果的可靠性和可重复性。如果对特定步骤有疑问，务必查阅具体的实验方案或咨询有经验的同事。

 

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