实验中培养基灭菌后颜色变深的主要原因及预防措施！

 

百欧博伟生物：培养基灭菌后颜色变深是实验室中常见的现象，可能影响实验结果判断或微生物生长。以下从原因分析和预防措施两方面进行系统总结：

 

一、颜色变深的主要原因

 

1、美拉德反应（Maillard Reaction）

 

机制：还原糖（如葡萄糖）与氨基酸/多肽在高温下发生非酶促褐变反应，生成类黑素等褐色产物。

 

常见场景：含葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨的培养基（如LB培养基）灭菌后易出现。

 

2、糖的焦化（Caramelization）

 

机制：高温导致糖类（如葡萄糖、蔗糖）脱水碳化，形成焦糖色素。

 

诱因：灭菌温度过高、时间过长或局部受热不均（如高压灭菌锅内蒸汽循环不畅）。

 

3、pH变化与成分分解

 

pH下降：灭菌后培养基pH通常降低（如磷酸盐缓冲体系分解产酸），可能激活某些显色反应。

 

敏感成分分解：如维生素（B族）、某些金属离子（Fe³）或有机物（如酪蛋白水解物）高温下分解产生有色物质。

 

4、金属离子影响

 

铁离子氧化：Fe²在高温下氧化为Fe³，可能与磷酸盐、酚类物质结合形成沉淀或显色。

 

其他金属：Cu²、Mn²等也可能参与氧化反应。

 

5、氧气与热力学作用

 

高温高压下氧气溶解度增加，促进氧化反应（如酚类物质氧化变棕）。

 

二、预防措施

 

1、优化灭菌参数

 

缩短灭菌时间：在保证灭菌效果的前提下，将高压灭菌时间从20分钟缩短至15分钟（需验证灭菌彻底性）。

 

降低灭菌温度：对热敏感培养基可采用115°C灭菌（需延长灭菌时间，需验证有效性）。

 

分步灭菌：

 

对含糖培养基：将糖类单独过滤除菌（0.22μm滤膜），灭菌后加入已灭菌的其他成分。

 

对含热敏感成分（如维生素）：分开灭菌或后添加。

 

2、调整培养基配方

 

替换碳源：用不易焦化的糖类（如甘油、山梨醇）替代葡萄糖。

 

使用缓冲体系：添加HEPES、MOPS等缓冲剂，稳定灭菌前后pH。

 

预调pH：灭菌前将pH调高0.2-0.5（如从7.0调至7.3），抵消灭菌后pH下降。

 

减少金属离子：避免过量添加Fe、Cu等金属盐，或改用螯合剂稳定金属离子。

 

3、工艺改进

 

快速冷却：灭菌后立即冷却（如冰浴），缩短高温暴露时间。

 

避免过度加热：灭菌结束后及时排气，防止培养基在灭菌锅内余热下持续反应。

 

分装与容器选择：

 

分装均匀，避免过厚液体导致传热不均。

 

使用耐高温玻璃瓶替代塑料瓶，减少局部过热。

 

4、特殊处理

 

添加抗氧化剂：如0.1%硫代硫酸钠（需验证对微生物无抑制）。

 

避光保存：灭菌后培养基避光存放，减少光氧化反应。

 

三、验证与注意事项

 

1、灭菌效果验证：调整参数后需通过生物指示剂（如嗜热脂肪芽孢杆菌孢子）确认灭菌彻底性。

 

2、营养成分测试：颜色改善后需验证培养基仍支持目标微生物生长（如接种测试菌株观察生长情况）。

 

3、分步灭菌的兼容性：过滤除菌的糖类需确保与其它灭菌成分无菌混合。

 

四、实例参考

 

含葡萄糖的培养基：采用115°C 20分钟灭菌，或分开灭菌糖与其他成分。

 

含FeSO的培养基：添加0.01% EDTA并预调pH至中性，减少Fe³沉淀。

 

通过针对性调整配方和灭菌工艺，可显著减少颜色变化，同时维持培养基的理化性质和营养功能。

 

北京百欧博伟生物技术有限公司拥有对菌种、细胞、培养基、配套试剂等产品需求者的极优质服务，对购买项目的前期资料提供,中期合同保证,后期货物跟踪到最终售后的确保项目准确到位，都有相关人士进行维护,确保您在微生物菌种查询网中获得优质服务！也正因为此，北京百欧博伟生物技术有限公司与国内外多家研制单位、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着良好、长期和稳定的合作关系！