猪支原体培养基的作用原理与使用方法及常见问题与解决！

 

猪支原体（如猪肺炎支原体 Mycoplasma hyopneumoniae）的培养基设计基于其特殊的营养需求和生长特性。以下从原理和使用方法两方面进行说明：

 

一、培养基原理

 

1、支原体的生物学特性

 

支原体是无细胞壁的原核生物，依赖宿主或培养基提供固醇类物质和脂肪酸。

 

生长缓慢，对营养要求苛刻，需复杂培养基成分。

 

对青霉素等抑制细胞壁合成的抗生素不敏感，但培养基中常添加抗生素抑制杂菌。

 

2、关键培养基成分及作用

 

基础培养基：常用改良的SP-4培养基，提供基础碳源、氮源及矿物质。

 

动物血清（如猪血清、马血清）：提供胆固醇、脂肪酸和生长因子。

 

酵母提取物：补充维生素B群、核苷酸等。

 

葡萄糖：作为主要碳源，支原体通过糖酵解代谢。

 

pH指示剂（如酚红）：监测代谢产酸导致的pH变化。

 

抗生素（如青霉素、多黏菌素）：抑制革兰氏阳性/阴性细菌污染。

 

二、使用方法

 

1、培养基配制（以改良Friis培养基为例）

 

配方示例：

 

基础肉汤（胰蛋白胨、酵母提取物等）

 

葡萄糖（终浓度0.5-1%）

 

猪血清（10-20%）

 

青霉素（1000 IU/mL）

 

酚红（0.002%）

 

步骤：

 

溶解基础成分，调节pH至7.6-7.8。

 

高压灭菌（121, 15分钟），冷却后无菌加入过滤除菌的血清和抗生素。

 

分装至无菌试管或培养瓶，4保存备用。

 

2、样本处理与接种

 

样本来源：猪肺组织、气管拭子或支气管肺泡灌洗液。

 

预处理：

 

组织样本研磨后过滤（0.45 μm膜）去除杂菌。

 

液体样本可离心富集后悬浮于培养基。

 

接种：按1:10比例将样本加入培养基，避免过度稀释。

 

3、培养条件

 

温度：37恒温。

 

气体环境：微需氧（5% CO）或厌氧罐中补充5% H + 95% N（部分菌株需要）。

 

培养时间：7-21天，定期观察颜色变化（酚红变黄提示产酸）。

 

4、观察与鉴定

 

菌落特征：在固体培养基上形成细小（0.1-0.3 mm）、透明“煎蛋状”菌落（中心致密，边缘透明）。

 

镜检：吉姆萨染色可见多形性（球形、丝状），无细胞壁。

 

代谢试验：精氨酸水解或葡萄糖发酵试验（依菌种而定）。

 

5、传代与保存

 

传代：取对数生长期培养物（pH显著下降时），按10%接种量转接至新鲜培养基。

 

保存：-80加入15%甘油或冻干保存。

 

三、注意事项

 

污染控制：支原体生长缓慢，易被杂菌掩盖，严格无菌操作。

 

血清批次筛选：不同批次血清可能影响生长，需预实验验证。

 

气体环境优化：部分猪支原体需特定气体比例，可尝试调整CO浓度。

 

生物安全：M. hyopneumoniae为猪呼吸道病原体，操作需在BSL-2实验室进行。

 

四、常见问题与解决

 

培养失败：检查血清活性、气体环境或尝试添加丙酮酸钠（0.1%）促进生长。

 

杂菌污染：增加抗生素浓度（如加万古霉素50 μg/mL）或重新过滤样本。

 

菌体自溶：及时传代，避免培养时间过长。

 

通过上述步骤可有效培养猪支原体，但其生长条件苛刻，需结合菌株特性调整培养基配方及培养参数。

 

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