流式细胞术实验前的准备工作与实验步骤及注意事项！

 

流式细胞术（Flow Cytometry）是一种通过检测细胞表面或内部标记物来分析细胞特性的技术，广泛应用于免疫学、肿瘤学等领域。以下是流式细胞术的常规实验步骤：

 

一、实验前准备

 

1、仪器准备

 

打开流式细胞仪，预热激光器，运行校准微球进行仪器校准。

 

检查鞘液和废液桶，确保液量充足。

 

2、试剂准备

 

PBS缓冲液（含1% BSA或FBS，用于封闭非特异性结合）。

 

荧光标记抗体（根据实验需求选择单标或多色组合）。

 

细胞固定/破膜试剂（如进行胞内染色）。

 

可选：细胞活性染料（区分死细胞）。

 

3、样本制备

 

细胞悬液：贴壁细胞用胰酶消化后重悬，悬浮细胞直接收集。

 

血液样本：用红细胞裂解液去除红细胞。

 

组织样本：机械或酶解（如胶原酶）消化成单细胞悬液。

 

用40 μm滤网过滤细胞，去除细胞团块，调整细胞密度为1×10~1×10/mL。

 

二、抗体标记（表面染色）

 

1、封闭（可选）

 

加入含1% BSA或同源血清的PBS，室温避光孵育10分钟，封闭非特异性结合位点。

 

2、抗体孵育

 

将细胞悬液分装至流式管，每管加入适量荧光抗体（参考说明书，通常1~5 μg/10细胞）。

 

避光，4孵育30分钟（或室温15分钟）。

 

3、洗涤

 

加入2 mL PBS，300×g离心5分钟，弃上清，重复2次。

 

三、胞内染色（可选步骤）

 

1、固定

 

加入4%多聚甲醛（PFA）或预冷的70%乙醇，室温避光固定15~20分钟。

 

2、破膜

 

用破膜缓冲液（含0.1% Triton X-100或商品化破膜剂）处理细胞10~15分钟。

 

3、胞内抗体孵育

 

加入针对胞内抗原的抗体（如细胞因子、转录因子），避光孵育30~60分钟，洗涤2次。

 

四、上机检测

 

1、样本重悬

 

用300~500 μL PBS重悬细胞，立即上机检测（或4避光保存，24小时内检测）。

 

2、仪器设置

 

设置阈值（FSC/SSC排除碎片），调节电压使细胞群位于合适区域。

 

使用单阳对照调节荧光补偿（补偿矩阵）。

 

3、数据采集

 

每个样本至少采集1×10个细胞，保存为FCS格式文件。

 

五、数据分析

 

1、圈门策略

 

Step 1: FSC-A vs SSC-A，圈出目标细胞群（排除碎片和死细胞）。

 

Step 2: 排除细胞团块（FSC-H vs FSC-A）。

 

Step 3: 根据荧光通道分析目标标记物表达。

 

2、软件分析

 

使用FlowJo、BD FACSDiva、Kaluza等软件分析阳性细胞比例、平均荧光强度（MFI）。

 

六、注意事项

 

1、细胞活性：尽量保持细胞活性＞90%（死细胞易非特异性结合）。

 

2、抗体用量：需预实验优化抗体浓度，避免过量导致背景高。

 

3、同型对照：使用同型IgG作为阴性对照，排除非特异性信号。

 

4、多色实验：注意荧光染料的光谱重叠，合理设计panel。

 

以上步骤可根据具体实验需求调整，如细胞周期、凋亡检测需额外处理。

 

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