《宏基因组学测序技术在成人医院获得性肺炎中的临床应用专家共识》（2023）要点

摘要：  医院获得性肺炎主要是指包括细菌、真菌、病毒、原虫及支/衣原体等病原体在入院 48 h 后引发的各类肺实质炎症。对于不明病原体感染的医院获得性肺炎，宏基因组测序技术能够检测几乎所有病原体核酸，所以该技术尤为适用于病原检测。宏基因测序技术实验流程操作略显繁琐，分析流程复杂，检测结果冗长，因此对实验室操作人员及解读人员的素质要求颇高，对相关的质量控制也需要标准化。简述了该技术在医院获得性肺炎中的应用及关键环节的质量控制。

医院获得性肺炎(HAP)是指至少在入院48h 后发生的肺炎，患者住院期间未接受有创机械通气、未处于病原感染的潜伏期，而于入院48h后新发，是常见的医院获得性感染疾病。2018年全国医院感染横断面调查报告显示，在26 790例发生医院感染的患者中，共分离出医院感染病原菌11 965 株，其中来自下呼吸道标本最多，占51.7%。据调查分析，美国急诊医院获得性感染的发生率为4.0%，其中最常见的感染是肺炎，占21.8%。国内外研究结果均显示，HAP在医院获得性感染中所占比例居首位。与此同时，抗菌药物的不合理使用造成了医院耐药菌的产生，使得HAP诊断和治疗的难度增加，住院时间延长，医疗费用上升，发病率及病死率增高。我国一项不同城市的教学医院对HAP临床调查的结果显示，HAP患者的平均住院时间显著高于同期其他住院患者，其住院平均治疗费用亦显著高于同期呼吸科住院患者平均住院费用。因此，快速诊断病原体及其耐药情况，及时恰当使用抗感染药物对于HAP患者的诊疗和康复至关重要。传统的HAP病原微生物检测方法主要包括痰或支气管肺泡灌洗液(BALF)的涂片、培养、核酸检测以及血清样本生物标志物的免疫学检测，这些方法无法满足临床需求，尤其是无法快速识别罕见或者未知的病原体。

宏基因组二代测序技术(mNGS)通过直接提取临床样本中的核酸进行文库构建和高通量测序，利用生物信息学算法分析样本中包含的病原微生物序列的种类及耐药基因和毒力基因，能够快速并且准确地检测各种临床样本中的病原微生物，显著提高病原检测的敏感性，大大缩短检测时间。mNGS检测范围广泛，能同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫等，在罕见和新发病原体的诊断及溯源上具有显著优势；同时，mNGS提高了肺部混合感染及真菌感染的诊断准确性，所以对于检测肺部感染病原体上具有重要作用和临床意义。但mNGS应用于临床尚有诸多问题需要解决，包括标本中人源污染影响低丰度微生物检出、生物信息学分析复杂、检测特异性略差、需专业人士进行结果解读等，特别是呼吸道本身存在大量定植菌，需结合流行病学和临床特征，综合评估检测结果是否为致病菌，使得临床医生和检验人员对临床结果进行正确判读具有一定的挑战性。

mNGS对于耐药基因的分析可以指导抗生素的使用。

1  检测流程

共识1：  建议HAP患者开展mNGS 检测时，最好采集支气管肺泡灌洗液或者气道抽吸物。

共识2：  建议HAP患者如存在免疫功能低下、基础疾病严重或病情危重时，且在经济允许的情况下，进行微生物培养送检的同时开展mNGS检测。

1.1   样本采集

共识3：  在流感病毒、冠状病毒等RNA病毒流行期间，建议HAP患者开展宏基因组检测时，首选DNA和 RNA 检测项目。

1.2   样本预处理

1.3  核酸提取

共识4：  建议HAP患者开展mNGS检测时，要求相关实验室测序数据量至少保证10M以上。

1.4  文库构建

1.5  上机测序

共识5：  建议HAP患者开展mNGS检测时，临床检测报告中要体现内参和对照品的检测合格性。

1.6  内参及对照品

共识6：  建议HAP患者开展mNGS检测时，检测结果要结合基础疾病史、临床其他检测结果综合考虑。

1.7  生物信息学分析

1.8  出具报告

2  mNGS报告解读规则

mNGS 阳性阈值受到多种因素的影响，如测序平台、测序流程、测序数据量、样本类型、病原种类、患者情况等。目前，不同实验室结合实验与临床，确定出了不同的阳性阈值。对于感染病原微生物的判断还要考虑其在参考基因组的覆盖度，覆盖度越大，可信度越高。mNGS的结果代表临床标本中检出某微生物的核酸片段，不能明确该物种与感染的关系，所以需要结合临床考虑。主要为mNGS检测结果与临床信息相结合进行临床判读，临床信息库包括病原微生物感染后的疾病症状知识库、医学检验报告知识库、影响检查报告知识库、耐药数据库、流行病学知识库、感染因素知识库等。

2.1  阳性结果的解读

共识7：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如检测到多种细菌时，需要考虑混合感染，同时结合临床表现综合考虑主要感染源。

2.1.1  一般细菌。

共识8：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如检测到毒力基因，需要重点考虑高毒力肺炎克雷伯菌，如

检测到耐药基因，避免使用耐药基因对应的抗生素，但可以通过药敏试验对耐药基因进行验证。

2.1.2  毒力基因及耐药基因。

共识 9：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如患者为严重的粒细胞减少或严重的细胞免疫缺陷继发HAP 时，除重点关注一般细菌外，真菌、病毒和胞内菌等机会性感染也需重点关注。

共识10：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如检测到嗜肺军团菌，需要考虑是否存在院内供水污染等情

况。

2.1.3  胞内菌。

共识11：  建议HAP患者开展mNGS 检测时，如检测到支原体和衣原体，需要考虑是否存在院内污染。

2.1.4  衣原体和支原体。

共识12：  建议HAP患者开展mNGS 检测时，如检测到常见的口腔定植菌，需要考虑是否存在机械通气和误吸等情况。

2.1.5  口腔定植菌。

共识13：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如患者有持续性严重的免疫缺陷症如艾滋病、中性粒细胞减少症等，检测到真菌且针对用药无效时，需要结合流行病学情况等考虑真菌耐药的可能。

2.1.6  真菌。

共识14：  建议HAP患者开展mNGS检测时，如检测到常见的呼吸道相关病毒时，结合该病毒流行病学情况，同时关注患者是否存在流行病学接触史，参考血清IgM抗体和IgG抗体的情况综合考虑。

2.1.7  病毒。

共识15：  建议HAP患者开展mNGS时，如果检测结果为阴性，可以针对临床可疑的微生物进行PCR验证，同时阴性结果对于排除感染具有较好的阴性预测意义，但需要结合其他检测结果综合考虑。

2.2  阴性结果的解读

在标本采集合格、运输规范的前提下，呼吸道感染标本较易检出病原微生物。对于阴性报告，需要结合患者的情况进行具体分析，一方面考虑患者是否已不存在感染性疾病；另一方面，明确送样前患者是否已经进行抗感染治疗用药，再根据具体的临床信息，判断低于报出阈值的致病菌是否有可能为患者感染病原菌。如不能排除感染，检测结果又没有符合临床的病原菌，可以考虑是否为胞内菌感染，如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌等，又或者是RNA病毒感染。

3  mNGS在HAP中的应用展望

由于mNGS的高敏感度能够得到样本中的所有微生物，一次性检测囊括了样本中正常微生物群、瞬时定植菌、样本污染和/或病原微生物，如何区分感染病原与定植菌群是关键性的难题。

3.1  宿主免疫应答

3.2  科室病原谱

3.3  床旁监测

4  结语

在我国HAP的发生占医院获得性感染的首位，尤其是在重症监护病房(ICU)中发生率很高，因此抗菌药物的使用必须尽早且适当，这对 HAP 患者的临床结局至关重要。mNGS病原检测对于HAP患者，尤其是ICU患者而言，能减少其他尝试性药物使用过程带来的经济和时间成本，及时进行诊断可以改善预后，降低整体综合治疗费用。但由于呼吸道本身并非无菌状态，大量定植菌核酸的存在给mNGS病原检测结果的临床判读带来挑战，需要综合考虑临床情况以制定相应的治疗方案。

〔本资料由朱明恕主任医师根据《宏基因组学测序技术在成人医院获得性肺炎中的临床应用专家共识》（2023）编写〕

（本共识刊登于《中国急救复苏与灾害医学杂志》2023年第5期。如欲全面详尽了解，请看全文）

                2023.6.7