液体石蜡保藏法的适用微生物菌种边界总结与选择建议！

 

百欧博伟生物：液体石蜡保藏法基于“隔绝氧气、保持水分、降低代谢”的核心原理，适用于绝大多数微生物的中长期保藏（1-5 年），但对微生物的代谢类型、营养需求及对矿物油的耐受性有明确要求。以下从“核心适用菌种”“条件适用菌种”“不适用菌种”三个维度系统梳理，并结合菌种特性说明适用逻辑，为实际保藏选择提供依据。

 

一、核心适用菌种（保藏成功率≥90%，优先推荐）

 

这类菌种对氧气需求适中、不敏感于矿物油，且抗逆性较强，在液体石蜡的物理屏障保护下，能稳定进入休眠状态，保藏期内活性和生物学特性不易退化。

 

1、细菌

 

革兰氏阳性细菌：

 

芽孢杆菌属（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌）：芽孢抗逆性强，油层隔绝氧气后可长期存活（保藏期 3-5 年）；

 

葡萄球菌属（如金黄色葡萄球菌）、链球菌属（如肺炎链球菌）：需氧或兼性厌氧，油层适度缺氧可抑制过度代谢；

 

放线菌（如链霉菌属、诺卡氏菌属）：兼性厌氧，液体石蜡可防止培养基干燥，适配其菌丝体和孢子的保藏（保藏期 2-5 年，部分可达 8 年）。

 

革兰氏阴性细菌：

 

肠杆菌科（如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌）：兼性厌氧，对数生长期保藏后复苏率高；

 

假单胞菌属（如铜绿假单胞菌）：需氧菌，油层不完全隔绝氧气（少量氧气可通过油层扩散），可满足其基础代谢需求，避免死亡；

 

根瘤菌属、固氮菌属：与植物共生细菌，保藏后仍能保持固氮活性。

 

2、酵母菌

 

酿酒酵母、假丝酵母属、汉逊酵母属等绝大多数酵母菌：兼性厌氧，对矿物油耐受性强，液体石蜡保藏可有效防止其因脱水或代谢过快死亡，保藏期 2-5 年；

 

应用场景：实验室常用酵母菌株、工业发酵用酵母（如啤酒酵母、面包酵母）。

 

3、霉菌

 

青霉属（如产黄青霉）、曲霉属（如黑曲霉、米曲霉）、木霉属、毛霉属等：

 

霉菌的菌丝体和孢子对矿物油不敏感，油层可保护孢子免受干燥和氧气影响，保藏期 3-10 年（孢子类菌种保藏期更长）；

 

注意：需确保霉菌在斜面上充分产孢后再加入液体石蜡，孢子的抗逆性强于菌丝体，保藏成功率更高。

 

二、条件适用菌种（需优化保藏条件，成功率 60%-80%）

 

这类菌种对保藏条件（如培养基、温度、油层厚度）有特殊要求，需针对性调整才能稳定保藏，否则易出现存活率低或特性退化。

 

1、兼性厌氧细菌（如乳酸菌属、双歧杆菌属）

 

适用条件：需使用营养丰富的培养基，保藏温度控制在 4（避免室温下代谢活跃），油层厚度可适当减薄（0.3-0.5cm），保留少量氧气供其基础代谢；

 

注意：若油层过厚导致完全厌氧，可能抑制其生长，复苏后活性下降，建议保藏周期缩短至 1-2 年，每 6 个月复核一次。

 

2、部分丝状真菌（如白僵菌、绿僵菌）

 

适用条件：斜面培养基需添加适量碳源，培养至孢子成熟后，将液体石蜡预热至 30-40后再加入（避免低温刺激孢子），保藏于室温避光处；

 

注意：避免 4低温保藏，否则可能导致孢子萌发率下降。

 

3、小型藻类（如小球藻、栅藻）

 

适用条件：使用 BG11 培养基斜面，保藏前确保藻类处于静止期（减少代谢需求），油层厚度 0.5cm，保藏于弱光或避光环境（避免光照导致藻类过度光合作用消耗营养）；

 

注意：保藏期较短（1-2 年），需定期复苏传代。

 

三、不适用菌种（保藏成功率＜50%，不推荐使用）

 

这类菌种的代谢特性或生理结构与液体石蜡的保藏原理冲突，使用该方法易导致菌种死亡、污染或特性丧失，需选择其他保藏方式。

 

1、严格厌氧菌（如破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、甲烷菌）

 

不适用原因：液体石蜡虽能隔绝氧气，但无法提供严格厌氧环境（油层下仍残留少量氧气），且部分严格厌氧菌对矿物油敏感，会因油层压迫或化学刺激死亡；

 

替代方案：采用庖肉培养基保藏、厌氧袋密封保藏或冷冻干燥保藏法。

 

2、对矿物油敏感的微生物

 

支原体、衣原体：无细胞壁，矿物油可能渗透进入细胞内，破坏细胞膜结构，导致细胞裂解；

 

部分原生动物：细胞膜脆弱，油层会影响其气体交换和营养吸收，保藏后迅速死亡；

 

替代方案：支原体用改良培养基传代保藏或 - 80超低温保藏，原生动物用生理盐水悬浮后 4短期保藏。

 

3、需长期保藏或高价值菌种（如基因工程菌株、稀缺野生菌株）

 

不适用原因：液体石蜡保藏期仅 1-5 年，长期保藏可能导致菌种退化，且无法满足菌种资源库的长期保存需求；

 

替代方案：优先选择冷冻干燥保藏法（保藏期 10 年以上）或 - 80/-196超低温保藏法（添加保护剂如甘油、DMSO）。

 

4、代谢活跃的嗜热菌（如嗜热脂肪芽孢杆菌）

 

不适用原因：嗜热菌最适生长温度≥55，即使在 4保藏，其代谢速率仍高于中温菌，液体石蜡无法有效抑制其营养消耗，保藏期极短（＜6 个月），且易出现自溶；

 

替代方案：采用冷冻干燥保藏法，或使用高温灭菌后的土壤作为载体保藏。

 

5、病毒（如噬菌体、动物病毒）

 

不适用原因：病毒无独立代谢系统，需依赖宿主细胞存活，液体石蜡无法提供宿主细胞支持，且病毒颗粒可能被矿物油吸附或破坏，导致感染力丧失；

 

替代方案：病毒液中添加 50% 甘油，-80超低温保藏，或冷冻干燥保藏（需添加保护剂如牛血清白蛋白）。

 

四、适用边界总结与选择建议

 

微生物类别           适用情况       保藏期参考       关键优化条件

 

细菌（中温、兼性厌氧/需氧）  优先推荐  1-5 年  对数生长期接种，4避光，油层 0.5-1cm

 

放线菌、酵母菌、霉菌  优先推荐  2-10 年  孢子/对数期菌种，室温/4避光

 

兼性厌氧乳酸菌、双歧杆菌  条件适用  1-2 年  营养丰富培养基，薄油层（0.3-0.5cm）

 

小型藻类  条件适用  1-2 年  静止期菌种，弱光环境，BG11 培养基

 

严格厌氧菌、支原体、病毒  不适用  选择冷冻干燥/超低温/专用培养基保藏

 

嗜热菌、高价值菌株  不适用  冷冻干燥保藏法（长期）

 

选择核心逻辑：

 

若为实验室常规中温菌（细菌、酵母、霉菌），且保藏周期 1-5 年，优先使用液体石蜡保藏法（操作简单、成本低）；

 

若为严格厌氧、对矿物油敏感或需长期保藏的菌种，直接排除液体石蜡法，选择针对性保藏方式；

 

条件适用菌种需先进行预实验：将菌种按液体石蜡法保藏 3 个月后复苏，验证存活率和生物学特性（如菌落形态、功能活性），确认稳定后再批量保藏。

 

通过以上分类梳理，可快速判断目标菌种是否适配液体石蜡保藏法，同时结合保藏周期、菌种价值等因素，实现保藏方法的精准选择，确保菌种活性和特性的稳定性。

 

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