微生物简单染色（单染色）原理与标准流程及注意事项！

 

百欧博伟生物：简单染色是利用单一染料对微生物进行染色的基础技术，核心目的是使微生物细胞与背景形成颜色对比，便于观察细胞形态、大小和排列方式（适用于细菌、酵母菌等）。以下是标准化操作流程、原理及关键注意事项，兼顾实用性和合规性：

 

一、染色原理

 

简单染色的核心是利用染料与细胞的亲和力：

 

常用染料为碱性染料（如结晶紫、美蓝、番红），其阳离子与细菌细胞壁（含肽聚糖，带负电）发生静电吸附，使细胞着色；

 

背景为中性/酸性，不吸附染料，形成清晰对比；

 

无需分化步骤，操作简便，适用于快速观察细胞基本形态。

 

二、实验材料

 

1、样品

 

液体样品：细菌菌液（培养 18-24h，对数期细胞活性高、形态典型）；

 

固体样品：菌落（挑取少量，用无菌水稀释成菌悬液）。

 

2、试剂

 

染色液：结晶紫染液（0.1%）、美蓝染液（0.1%）、番红染液（0.5%）（三选一，结晶紫染色效果最稳定）；

 

辅助试剂：无菌生理盐水（0.85% NaCl，维持细胞渗透压，避免细胞破裂）、蒸馏水（冲洗用）。

 

3、器材

 

载玻片（经酸液清洗、灭菌，无油污）、盖玻片、接种环（灭菌）、酒精灯、显微镜（含油镜）、吸水纸、滴管。

 

三、标准操作流程（6 步核心法）

 

1、涂片（关键：薄而均匀）

 

取一块洁净载玻片，用滴管滴 1 滴无菌生理盐水于载玻片中央；

 

用灭菌冷却后的接种环，挑取少量样品（菌液取 1 环，固体菌落挑取针尖大小），放入生理盐水中轻轻研磨，使样品均匀分散（避免细胞聚集，影响观察）；

 

用接种环将菌悬液涂成直径 1-2cm 的薄涂片（涂片过厚会导致染色不均、脱片，过薄则细胞过少）；

 

自然干燥（或置于酒精灯火焰上方 5-10cm 处烘干，避免高温烤死细胞，导致形态畸变）。

 

2、固定（目的：杀死细胞 + 使细胞黏附载玻片）

 

待涂片完全干燥后，手持载玻片两端，将涂片面朝上，快速通过酒精灯火焰2-3 次（每次 2-3 秒，以载玻片背面不烫手为宜）；

 

固定时避免火焰直接灼烧涂片（否则细胞会碳化，无法观察形态）。

 

3、染色（控制时间，避免过染/欠染）

 

用滴管向涂片上滴加染色液，使染色液完全覆盖涂片区域（无需过量）；

 

染色时间：结晶紫/番红染 1-2min，美蓝染 3-5min（碱性染料染色时间较短，过染会导致背景着色，欠染则细胞颜色过浅）。

 

4、冲洗（关键：水流轻柔，避免冲掉细胞）

 

染色结束后，手持载玻片倾斜 45°，用缓慢流动的蒸馏水从涂片上方冲洗（水流方向与涂片平行，避免垂直冲洗冲击细胞）；

 

冲洗至流出的水呈无色为止（残留染料会导致背景浑浊）。

 

5、干燥（避免细胞变形）

 

用吸水纸轻轻吸去涂片上的水分（吸水纸从边缘向中心按压，切勿擦拭，否则会擦掉细胞）；

 

若仍有少量水分，可再次置于酒精灯上方烘干（或自然干燥），确保涂片完全干燥（否则油镜观察时会出现气泡）。

 

6、镜检（从低倍镜到油镜）

 

先在低倍镜（10×）下找到涂片区域，再换高倍镜（40×）定位细胞；

 

滴 1 滴香柏油于涂片中央，换油镜（100×）观察，调节细准焦螺旋，直至细胞清晰；

 

观察结果：细胞呈染料颜色（结晶紫→紫色，美蓝→蓝色，番红→红色），背景无色，可观察细胞形态（球菌、杆菌、螺旋菌）、大小及排列方式（单生、链状、葡萄状等）。

 

四、关键注意事项（影响成功率的核心要点）

 

1、涂片质量控制

 

必须薄而均匀：涂片过厚→染色不均、脱片；过薄→细胞数量少，难以统计；

 

避免气泡：研磨菌悬液时轻柔操作，防止产生气泡，影响观察。

 

2、固定操作规范

 

火焰固定次数：2-3 次为宜，过多→细胞碳化；过少→细胞未固定，冲洗时易脱落；

 

接种环冷却：灭菌后需在无菌培养基边缘冷却 3-5 秒，避免高温杀死细胞。

 

3、染色时间控制

 

严格遵循染料对应的时间：结晶紫 1-2min（最佳 1.5min），过长会导致背景着色，过短则细胞着色浅；

 

染色液覆盖完全：避免涂片边缘未被染色，导致观察时漏检。

 

4、冲洗与干燥技巧

 

水流要缓：蒸馏水冲洗时，水流从涂片上方缓慢流下，避免直接冲击细胞；

 

吸水纸使用：仅按压吸水，不可擦拭，否则会破坏细胞形态。

 

5、镜检操作

 

油镜使用前确保涂片完全干燥：否则香柏油与水分混合，视野模糊；

 

观察后及时清洁油镜：用擦镜纸蘸少量二甲苯擦拭油镜镜头，再用干净擦镜纸擦净。

 

五、常见问题与解决方案

 

问题现象      可能原因         解决方案

 

细胞脱片  涂片过厚、固定不充分、载玻片有油污  涂片薄而均匀；增加火焰固定次数；载玻片用酸液清洗后灭菌

 

细胞着色浅  染色时间不足、染料浓度过低、细胞未固定  延长染色时间；使用新鲜配置的染色液；确保固定充分

 

背景浑浊  冲洗不彻底、染色液过量  延长冲洗时间，直至流出水无色；染色时仅覆盖涂片即可，避免过量

 

细胞形态畸变  高温灼烧、生理盐水浓度不当  固定时避免直接灼烧涂片；使用 0.85% NaCl 维持渗透压

 

六、应用场景

 

快速鉴定微生物基本形态（如区分球菌、杆菌）；

 

实验室常规质控（如菌种活化后观察细胞活性）；

 

教学实验中基础染色技术训练；

 

工业生产中微生物发酵液的快速镜检（如判断细菌生长状态）。

 

通过以上标准化流程，可确保简单染色的成功率和结果可靠性，为后续革兰氏染色、特殊染色等复杂技术奠定基础。操作时需严格遵循无菌操作规范，避免样品污染，确保实验结果的准确性。

 

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