加载中…初学者转染实验中要注意的问题：哪些因素影响RNA转染的效率？
(2019-11-29 14:04:05)
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初学者转染实验中要注意的问题：哪些因素影响RNA转染的效率？
既然都是核酸，传统的DNA转染方法都可以用来转染RNA，不过最头疼的就是RNA容易降解和防止RNAse污染。
RNA操作要注意的事项我们就不用罗嗦了，转染中要额外注意的就是转染试剂应该是确认无RNase污染的，而且也尽量避免和质粒DNA转染混用——即使试剂本身兼容DNA和RNA转染，你也要想到人家做质粒DNA转染时往往不会这么小心，难免将污染混入，那你岂不是很冤？多数情况下转染试剂都不建议自己分装，因为不同的管材可能会影响转染试剂的稳定性，那就更得不偿失了。所以RNA专用的转染试剂会更好一些。还有重要的一点就是要采用优质无RNAse污染的血清。
转染时的细胞汇合度常常会比DNA转染高一点，也许是因为RNA转染表达比DNA快？RNA转染的用量必须参考转染试剂说明，因为RNA和转染试剂的比例决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞。RNA少了固然表达不好，太多也会有毒性的问题。有的品牌转染试剂有促核酸凝聚的试剂，帮助核酸折叠为较为致密的结构。如果转染试剂对细胞没有太大影响，转染复合物和细胞共同孵育的时间越长当然越好。不过，如果RNA本身带有荧光标记的化，检测前通常要洗掉多余的RNA以免干扰结果。
除了操作，RNA本身的结构也对转染有一定的影响。哺乳动物的mRNA分子带有5\'端帽子结构和3\'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES（internal
ribosomal entry
site）的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性，或者有助于核糖体结合到mRNA上进行翻译。对于体外转录得到RNA可以通过实验加入模拟RNA5\'端帽子结构类似物而获得这个保护性的“帽子”，3\'端PolyA尾巴也可以通过实验添加。多数情况下添加这些元件有助于提高RNA进入细胞后的稳定性。但是有时候IRES元件促进翻译的进行，而到有的细胞株中，由于缺乏相应的结合蛋白，IRES反而影响转录。这个在RNA转染实验设计中是要格外注意的。RNA干扰实验中的siRNA结构对基因沉默效果也有影响。
不同的细胞和不同的实验目的，遇到的困难往往是难以预料的，所以无论前人是否已经为你提供了现成的方法，如果是初次尝试某种试剂或者某种细胞系，这几个对照是一定要做的：
空白对照，只加一定量核酸的对照，只加一定量转染试剂的对照，2个以上不同的量比实验，对于检查问题是非常有用的。
RFect小核酸转染试剂为例，首次实验siRNA的用量设置在终浓度10nM、30nM、50nM、100
nM进行摸索 ，后续实验要根据实验结果修改。转染实验需要优化最佳条件，siRNA用量在0.6-30 pmol（final concentration 1- 50
nM）之间调整，RFect试剂用量在1.0-3.0μl之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验，如实验结果不理想，可适当调整并摸索转染试剂用量。
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