加载中…原代、悬浮细胞难转染怎么办？成功转染第一步：细胞培养注意事项
(2019-11-19 13:10:29)
标签：
原代细胞悬浮细胞转染试剂细胞密度血清 |
成功转染第一步：细胞培养注意事项
细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要，有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞，通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法；而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素，姑且不论。不过因为受限于特定的细胞，如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法，照做可也。如果是个新来的细胞株，最好查查资料看哪些成功转染案例。
当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢？
一、健康而茁壮成长的细胞
转染前细胞最好经过1—2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率）。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
二、恰到好处的铺板密度
转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。以RFect质粒DNA转染试剂为例，一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数参见说明书,细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。
三、温暖舒适的培养基
健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性，需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。
血清
血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了，例如RFect转染试剂，在转染过程中是可以使用血清的。不过要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
细胞系的选择通常不是我们说了算的。有时是实验的需要，有时是实验室条件的限制。如果有选择的余地当然挑个容易做的。越是接近体内的真实情况的原代细胞，通常越是难于伺候。反之亦然。此外细胞本身的特性也是需要考虑的因素。有时需要根据细胞系来选择合适的转染方法；而有时一些启动子在不同的细胞系中表现的功能也不同。这些都是设计实验时需要考虑的因素，姑且不论。不过因为受限于特定的细胞，如何选择合适的转染方法就值得考究了。因为不同的细胞可能适用不同的转染试剂和转染条件。如果实验室已经建立了全套方法，照做可也。如果是个新来的细胞株，最好查查资料看哪些成功转染案例。
当实验进行到转染这一步时需要注意的因素有哪些呢？
一、健康而茁壮成长的细胞
转染前细胞最好经过1—2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24小时，因为一旦长满了，细胞们就“故步自封”不思转染啦。活力充沛的年轻细胞更容易接受外来的新鲜事物嘛。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率（融化细胞的进一步传代不会马上降低转染效率）。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
二、恰到好处的铺板密度
转染时的细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度各不相同，即使同一种试剂，也会因不同的细胞类型或应用而异。转染时过高或者过低的细胞密度会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。因此如果选用新的细胞系或者新的转染试剂，最好能够进行优化实验并为以后的实验建立一个稳定方法，包括适当的接种量和培养时间等等。一般转染时贴壁细胞密度为40%-80%，但这个需要参考所选转染试剂的说明书——阳离子脂质体具有微量的细胞毒性而往往需要更高的铺板密度或者更多的悬浮细胞数，有的要求细胞90%汇片；而有些多胺或者非脂质体的配方则要求在40%—80%之间，总之是尽量在细胞最适的生理状态下转染，以求最佳的转染效果。以RFect质粒DNA转染试剂为例，一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数参见说明书,细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。
不同的实验目的也会影响转染时的铺板密度，比如研究细胞周期相关基因等表达周期长的基因，就需要较低的铺板密度，所以需要选择能够在较低铺板密度下进行转染的试剂。需要特别注意。
三、温暖舒适的培养基
健康的细胞培养是一切成功转染的基础。不同的细胞类型有不同的特性，需要特定的培养基、血清、补充添加剂等等。
血清
血清一度曾被认为会降低转染效率，老一代的转染方法往往要求转染前后洗细胞或者在无血清培养基条件下转染，对于某些对血清要求敏感的细胞来说是个难题。不过转染产品配方几经革新后的今天，对于主流的转染试剂来说，血清的存在已经不会影响转染效率，甚至还有助于提高转染效率。对于多数可以在有血清条件下工作的转染试剂来说，血清的存在会影响DNA—转染复合物的形成，但只要在DNA-转染复合物形成时用无血清培养基来稀释DNA和转染试剂就可以了，例如RFect转染试剂，在转染过程中是可以使用血清的。不过要特别注意：对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染是值得关注的。所以血清的质量也是需要关注的。新加培养基的预热对细胞转染很有帮助。
抗生素
支原体、细菌、真菌污染，无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”，可能会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。
支原体、细菌、真菌污染，无论对于细胞培养或者转染都是“不堪回首的痛”，可能会严重影响转染结果，细胞培养过程中往往会添加抗生素来防止污染。但是这些添加剂可能对转染造成麻烦。比如青霉素和链霉素，就是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这可能间接导致细胞死亡，造成转染效率低。
喜欢
0
赠金笔