转染(transfection)是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。

以RFect Plasmid DNA Transfection Reagent非脂质体转染试剂，作为携带质粒穿膜的载体物质，具体介绍DNA转染方法。

图. 用本产品4ul转染1ug pEGFP-C2质粒到293T细胞后，绿色荧光蛋白的表达情况。

一、方法步骤:  

贴壁/悬浮细胞瞬时转染操作流程(以24孔板转染为例)

A. 细胞接种:

1. 转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞； 

2. 过夜培养。

B. RFect /DNA复合物包装(该步完成后应立即转染):

1. 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的转染试剂(2~5µl/µg DNA，参见下表) 。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。 

2. 在1.5 ml无菌离心管中加入50µl无血清培养基，并添加适量的DNA (0.8~1µgDNA/孔， 参见附表)。用移液器轻轻混匀后在室温静置5~10分钟。

3. 将RFect-培养基混合物滴加至DNA-培养基混合物中，用移液器轻轻混匀后在室温静置15~20分钟后，立即转染。注意： RFect-培养基混合物和DNA-培养基混合物的混合次序非常重要，切勿颠倒。

C.转染:

注意：RFect在完全培养基中(基础培养基中添加血清)具有很高的转染效率，因此转染前后不需要换成无血清培养基。

1. 如特殊情况，可在转染开始之前更换新鲜的含血清培养基，以防转染后孵育阶段细胞密度太大、营养不足导致的细胞死亡。

2. 将步骤B制备的复合物滴加至培养基中。轻轻晃动培养皿以使复合物均匀分布。 

3. 过夜培养24~48小时。 

4. 注意:如果转染后需要更换新鲜培养基，请于加入RFect/DNA复合物12~24小时后进行。培养基更换后，孵育24~48小时后再进行后续实验。

5. 收获细胞，进行后续实验。

二、实验准备及注意事项：

1. 细胞接种：一般做转染前一天接种/铺板（细胞计数参见说明书,细胞计数大约5*10^4cell/ml），使做转染前细胞密度在30-50%；如果细胞是原代细胞，接种密度可以密一些，细胞计数在2*10^6cell/ml；悬浮细胞可以在转染当天接种/铺板（细胞计数大约5*10^4cell/ml），待细胞状态稳定后做转染前细胞密度30-40%。

2. 为了能在使用时有较好的转染效果，第一次使用建议您用24孔板做，每孔1ug质粒，设置质粒转染试剂2ul,3ul,4ul三个梯度，每个梯度最好做2-3个复孔（至少2个复孔，避免实验误差）。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3。将最佳转染条件（质粒DNA与转染试剂的用量、比例）放大到对应的孔板即可。

3. 用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰DNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率；

4. 检测方法：转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测。

三、疑难问题及解决

1、低转染效率：  

1）转染试剂与质粒DNA的比例不合

根据建议选用最佳配比浓度，详见表格。

2）细胞状态不佳，过密或过稀疏

细胞状态不佳，细胞营养不良，细胞伸展不好，细胞密度稀疏，细胞过密都影响转染效率。转染前24小时左右对细胞进行转接，接种密度约为每孔0.3~1×105个细胞即可。

3）抗生素损伤细胞

转染培养基中含有抗生素会影响细胞转染效率。因为转染试剂相当于细胞打孔，这时培养基中存在抗生素则会进一步损伤细胞。

2．高细胞毒性： 

1）质粒DNA受内毒素污染，或其他化学物质的污染

未使用去内毒素的质粒试剂盒提取质粒，对细胞损伤很大。转染过程中会造成细胞死亡。 

2）转染后换液

使用传统的转染试剂，转染后4-6小时必须进行换液，否则会由于转染试剂毒性而引细胞死亡。本实验所采用的RFect试剂盒在完全培养基中具有很高的转染效率，操作简便，可用于含血清培养基培养细胞的转染，转染前后不需要更换培养液。

百代生物

RFect Plasmid DNA Transfection Reagent

RFect质粒DNA转染试剂盒

http://www.biodai.com.cn/show.asp?typeid=6&sortid=55&id=167