近年来，对于传染病疫情或者威胁，病原微生物基因组测序逐渐成为临床微生物领域的重要工具与手段，其应用包括：（1）病原体快速鉴定（特别是对未知或者无法培养的病原）；（2）通过病原体基因组变异，研究病原体随时间的变异情况，有助于疫情起源追踪与疫情监测；（3）研究病原体的耐药情况、毒力因子、与宿主的相互作用等，辅助疾病治疗与防控。

在高通量测序（NGS）问世前，病原微生物基因组分析主要借助于桑格测序技术（Sanger Sequencing）, 实验周期较长，检测成本也较高。科学发展与技术进步为病原体鉴定与分析提供了更加简洁高效的手段，NGS就是最好的例子。如今，NGS已经迅速成为临床实验室的重要检测平台，延展提高了经典微生物方法的检测能力（下图）。对于微生物基因组序列的测定，除测序设备外，计算机以及各种分析算法／软件，以及参考数据库也必不可少，它们共同组成基因组测序“三大件”。

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目前，借助于NGS，病原微生物基因组测序策略主要包括以下几种：

(1)  基于宏基因组学的测序：对于环境或临床样本，这种方法可用来查明病原，辅助诊断，以及了解微生物构成的多样性。该方法检测标本中的所有核酸，包含宿主和病原（包括细菌、病毒、真菌、寄生虫等）, 不需要对病原微生物基因组有先验知识，因此可以快速应答新发的传染病威胁，如突发传染性疫情的检测与监测。

宏基因组测序法主要优势在于无需靶向扩增，因不需要预知病原基因组序列信息。但由于宿主与病原的序列同时测出，病原体序列占比极少，所以如何有效的去除宿主序列，对标本处理及信息分析技术有较高要求。同时，对于临床样本的检测，如何区分定植与感染，也需要大数据量样本累积及临床经验综合判断。如需对病原体序列进行深入分析（耐药基因等），则需加大测序深度，其检测成本也有所提高。

我们采用宏基因组测序法，对临床不明原因发热、高度怀疑感染的血浆、脑脊液、肺泡灌洗液、痰液等样本进行检测，先后在不同样本中检测到了细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原微生物，为临床提供了有力的证据。初步的比较研究发现，对于疑似血流感染样本，高通量测序技术的检测阳性率为传统培养方法的2倍左右。

(2)  PCR扩增后测序：针对序列已知的病原体，先扩增富集该病原体基因片段之后再测序。可以用于对病原体耐药基因，毒力因子的分析。该方法的特异性、敏感性较高，测序成本较宏基因组方法更低。对于基因组较大的病原体，通过这种方法实现病原体全基因组测序会有一定困难。且该方法对于未知病源的感染无能为力。

(3) 目标DNA区域捕获并测序：设计核酸探针（生物素标记）互补结合到待测病原体的基因组区域，从而捕获特定的病原体基因组片段，继而对这些片段进行测序。这种方法主要用于对基因组较大病原的特定基因进行分析。该方法由于能精准获得目标区域序列信息，较宏基因组特异性高，较PCR扩增子测序循环数少，因扩增引入的错误也相对较少。该方法探针设计时需要参考全基因组序列，故无法对序列未知病源进行鉴定。

附表列举的是近年来采用NGS对病原体进行鉴定与分析的部分传染病疫情案例。疫情发生地点与时间主要参考新闻报道与相关论文。我单位参与了最后五次疫情分析。

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