2017年9月的绍兴模拟卷做到选修一中关于基因工程的题目，虽然题目在设置问题时做了回避，但是原理中还是涉及到了同源片段的基因重组。题目如下所示：

基因敲除是针对某个序列己知但功能未知的基因，改变其基因结构，令该基因功能丧失，从而对生物体造成影响，进而推测出该基因功能的一门技术。以下是制备APOE 基因敲除小鼠的常规过程。

备注：neo基因是抗新霉素的抗药基因；APOE是指载脂蛋白E，参与脂蛋白的代谢与转化。

（1）为了获得APOE基因，可以用       或者PCR扩增。过程②中所需的工具酶有                          。neo基因除了破坏APOE基因外，还具存的作用最可能是                   。

（2）培养小鼠胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备饲养层，用于饲养层的细胞—般是                。经过⑥克降以后的细胞的后裔细胞辟称为纯系，细胞纯系的特点是                 ，从而便于研究。

（3）纯合的APOE基因敲除小鼠     （能/不能）表达APOE，与正常小鼠相比表现出                              性状。

参考答案：（1）化学方法合成  限制性核酸内切酶和DNA连接酶         作为标记基因，便于筛选

（2）胚胎成纤维细胞  遗传性状均一，表现的性状相似

（3）不能    脂蛋白的代谢和转化异常

对高三的学生而言，一般都能答出正确答案，但是审题认真、程度稍微好一点的同学会发现一个问题：打靶载体中的APOE基因因为内部插入了一个neo基因，导致基因结构被破坏而失去功能；但是该载体导入到了小鼠正常的胚胎干细胞中，为什么能得到的却是APOE基因敲除了的细胞呢？

要回答这个问题，就需要先了解同源重组技术原理：基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图所示：

扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的Knockout ES细胞，以囊胚显微注射的方式将一定数量的Knockout ES细胞注入特定品系小鼠囊胚中，然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后，通过小鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低，以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。

将嵌合体小鼠与适当品系的小鼠交配，后代小鼠出生后，通过PCR方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有，则该小鼠为具备生殖遗传能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。

将嵌合体小鼠和适当品系野生型小鼠交配，通过后代小鼠毛色或PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。