探微细胞世界的“三剑客”：克劳德、德迪夫和帕拉德

撰文：吴志强（芜湖市第十二中学）

除病毒外的一切生物都由细胞构成，细胞是有机体结构和功能的基本单位。1665年英国科学家罗伯特•虎克利用自己发明的显微镜首次发现细胞，从而开启了细胞研究的大门。19世纪50年代施莱登和施旺提出的细胞学说确立细胞的重要性，并由此形成细胞生物学。随着新技术的发明及在生命科学领域的广泛应用，细胞生物学研究取得了质的飞跃，使人们对细胞亚显微水平的结构和功能有了全面的认识和理解，标志着现代细胞生物学时期的到来，在此过程中许多科学家都做出了卓越贡献。比利时裔美国科学家阿尔伯特•克劳德、比利时的克里斯汀•德迪夫和罗马尼亚裔美国科学家乔治•埃米尔•帕拉德就是其中最著名的“三剑客”。他们因为细胞结构和功能组织的发现而分享1974年的诺贝尔生理学或医学奖。诺贝尔奖委员会的评价是“三人的研究成就为现代细胞生物学诞生发挥了重要作用”。

勇于探幽入微的克劳德铁匠出生，却为全面深入研究细胞精细结构奠定了基础

克劳德于1899年生于比利时的布鲁塞尔，是一位著名的细胞生物学家，他帮助建立了现代细胞生物学，发展了一套用于分析细胞结构的方法。原本他是一个与学问毫无关系的铁匠，在学校读了几年书后，在他12岁那年就去了一家钢厂工作了。第一次世界大战期间，克劳德服役于英国情报局，并因为他的勇敢获得了奖章。战后为当一名铁匠师傅考入矿山学校，在学校里接触到化学后，萌生了做学问的念头。当时比利时政府宣布参加过一战的老兵不需要高中文凭就可以上大学，于是克劳德申请就读于列日大学的医学院。1928年，他顺利获得了医学博士的学位，并于次年前往柏林达拉姆的德皇凯撒威廉研究院继续他的博士后学习。最后于1929年加入纽约市洛克菲勒医学研究所继续他的研究工作。

在细胞学说创立后的100年间，人们对细胞的研究都只是停留在形态结构的简单描述水平，细胞里面一团胶状物究竟和何物，并未被人所知。克劳德决心把细胞内部的组分分离开。在1930年，克劳德首先发明了细胞组分分离技术，采用不同的转速对破碎的细胞进行离心，从而使研究人员可获得足够数量相对均匀的组织匀浆来进行细胞生物化学和形态学分析。这是一种沿用至今的定性定量分离细胞组分的经典方法。此外，他率先将电子显微镜作为亚细胞结构研究工具应用到生命科学领域研究，这也是他的又一项重大科学贡献。1945年，克劳德和他的同事发表了培养细胞的第一张电子显微镜照片，首次发现了一些新的细胞亚显微结构——线粒体和内质网，他们是第一个把线粒体定位为细胞的动力工厂的人。这次重大突破开创建立了细胞生物学，开启了现代细胞生物学的一扇大门，为随后全面深入研究细胞精细结构奠定了基础。

具有敏锐洞察力的德迪夫发现溶酶体，开启“替代疗法”方案的时代

德迪夫出生于英国伦敦郊外泰晤士迪顿，在安特卫普长大，精通英语、德语、法语和弗拉芒语四种语言。比利时人的父亲和德国人的母亲为躲避第一次世界大战，从比利时暂时搬到英国，直至1920年全家又搬回比利时。德迪夫在安特卫普的圣母学院完成初等教育，1934年秋进人天主教勒芬大学主攻古代人文。大学期间，德迪夫学习了拉丁文、哲学和数学等课程。但他逐渐发现对医学和科学更感兴趣，从而树立终身从事科研的理想。1938年，德迪夫毕业后一方面就读医学院并最终获得医学学位，另一方面开始研究胰岛素。

在第二次世界大战期间，德迪夫作为军医加人比利时军队为士兵服务。在法国南部执行任务时，不幸被德军俘获。在随后押往战俘营时凭借熟练的德语能力而成功逃脱。回到比利时后，德迪夫继续开始他的实验研究。

在1948年之后，德迪夫在勒芬大学一方面教授生物化学课一方面花费大量时间继续研究胰岛素的作用机制。德迪夫在运用差速离心技术分离细胞时发现，6－磷酸葡萄糖酶总是与微粒体一起被分离。当时人们普遍认为，微粒体是一些破碎的线粒体，但德迪夫却看到的是6－磷酸葡萄糖酶并不与线粒体一起被分离。而且采用细胞组分分级分离技术得到的酸性磷酸酶活性仅有用单纯酶纯化方法得到的10%。在一次实验获得大量细胞组分，由于时间原因而暂时放置冰箱以备后续利用，五天后取出实验却惊奇地发现酶活性基本恢复。德迪夫未放过这一偶然现象，并敏锐意识到这种现象背后可能隐藏着一个更大的秘密，因此全面转向酸性磷酸酶定位。德迪夫和他的同事除冷藏外，冷冻、加热和添加去污剂等操作均可提升匀浆酸性磷酸酶活性，这些结果进一步印证了该酶定位于膜包被的细胞器。德迪夫设计了一系列的鉴别实验，通过实验发现这种特殊的细胞结构内还含有一些小分子的酶类，并且能起到细胞内消化的作用。1955年，德迪夫把这种细胞结构命名为“溶酶体”。不久，电子显微镜观察证实了溶酶体的真实存在。科学的逻辑往往就是发现在“眼见为实”之前。

目前，已鉴定出五十多种溶酶体特异酶，它们既发挥正常的细胞内消化功能，又参与对入侵细菌、毒素、异常过程中发挥关键作用。溶酶体内特定酶基因突变或功能异常可导致相关疾病发生，如戈谢病和糖原贮积症II型等，这些统称溶酶体贮积病，德迪夫提出可通过补充相关酶而实现疾病治疗，从而开启“替代疗法”方案的时代。

善于利用和改进先进技术手段的帕拉德无愧“现代细胞生物学之父”的称号

帕拉德出生于罗马尼亚东北部雅西市的一个知识分子家庭，从小就获得了优良的家庭教育。雅西大学的哲学教授的父亲原本希望帕拉德能像自己一样在大学进行哲学研究，但帕拉德对这些抽象问题不感兴趣。他更喜欢一些切实可处理的科学，尤其对医学兴趣浓厚。从布泽乌学院毕业并获得学士学位后，凭借兴趣和努力，他顺利地进入罗马尼亚布加勒斯特大学医学院开始了医学教育。在系统完成三年医学训练后，帕拉德开始临床实习，不久成为布加勒斯特市民医院的住院医生，在此期间对多种临床疾病有了较为全面认识。尽管帕拉德在临床方面取得一定成就，但他更多的兴趣在于基础医学。几经工作变迁后，帕拉德进入钱伯斯实验室工作，并幸运的遇到了阿尔伯特.克劳德，从而改变了他的科研生涯。

帕拉德首先利用克劳德发明的细胞组分分离技术进行细胞组分研究，他与同事将肝脏组织匀浆离心获得两部分颗粒装结构，一种是容易沉淀的大颗粒部分，这部分中含有线粒体等细胞器，另一种是难沉淀的小颗粒部分，这些小颗粒的沉淀需要更大的离心力，因此被命名为微粒体。1958年帕拉德根据自己的研究将微粒体重新命名为核糖体。

帕拉德还在克劳德方法基础上进行了大胆改进，发明了蔗糖密度梯度离心来进行细胞组分分离，蔗糖相对于当时使用水或生理盐水而言是一个很大的进步，因为它避免了亚细胞成分分离过程中的粘着或涨破现象，该方法至今仍被广泛应用于细胞生物学研究。帕拉德与同事合作使用0.88M的蔗糖第一次分离并阐明了完整线粒体的结构特征，具有生物活性的线粒体的获得为生物能学研究提供了极大的便利，不久其他研究人员就发现线粒体具有三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化等作用，从而证明了线粒体是真核细胞进行能量转换的细胞器。

帕拉德在克劳德工作基础上进行了更深入研究，一方面改进了电子显微镜技术从而获得了细胞内部更为精细的结构，另外一方面也开始使用生物化学方法研究特定细胞器的化学组成以揭示其生物学功能。帕拉德对细胞电子显微镜研究的一项重大贡献是改进了细胞固定技术，他引入缓冲液方法以保证相对稳定的pH，从而改进了组织细胞结构的研究。此外，他还对电子显微镜研究的其他方面进行了革新，如塑料包埋材料的应用和超薄切片技术的完善，这使20世纪50年代早期细胞电子显微镜照片清晰度得到极大提高，从而发现了更多的细胞内细节。帕拉德开发和改进的许多细胞生物学研究方法在今天的实验室还被广泛应用。正如拉斯克奖评价的那样:帕拉德的基本发现将细胞概念拓展到令人难以置信的水平，生命的奇迹被精妙展现在人们面前，如核糖体、细胞内膜系统、细胞附着物和不同细胞类型的独有结构，对这些结构的理解远远超越光学显微镜的水平。帕拉德展示了一个全新的细胞内世界，为细胞功能与细胞精细结构紧密结合开创了先河。正是由于帕拉德对现代细胞生物学诞生和发展做出了许多奠基性贡献而被生物学界誉为“现代细胞生物学之父”。