DNA克隆的方法有很多种，比如传统的T4连接酶介导的DNA克隆、EASY克隆，无缝拼接克隆等，下面具体介绍一下这些克隆方法。

传统的分子克隆，通常需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段，使得载体和片段产生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA连接酶对其进行连接，转化，挑取阳性克隆，得到重组质粒（相关产品：T4 DNA Ligase）。

为了更方便的对DNA进行克隆，后续又将克隆的载体进行了简化，出现了T载体，这样就可以不用酶切，直接将片段连接到载体上，以便于DNA的保存及后续扩增。

以TA克隆为例来介绍整个连接过程。常规的连接是一个三分子共同反应的过程（图1），载体、片段和连接酶碰撞在一起，发生反应，完成连接过程。为了得到更多的阳性克隆，我们会倾向于加入更多的片段、载体和连接酶，以提高分子碰撞机率，但同时也会遇到一个问题，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串联体和载体自连的形成，反而导致片段和酶的利用率降低。所以在进行TA克隆时，并不是DNA和酶加入的越多越好。

使用这种方法进行克隆，如果需要连接平末端的DNA片段（比如Pfu类酶扩增的片段），则需要进行额外的加A尾反应（可以使用Taq酶完成加A）。

图1 T4连接酶介导的DNA片段与载体的连接（图片来源于网络）

EASY克隆的方法主要依赖于载体上所携带的拓扑异构酶。拓扑异构酶的生理作用主要体现在DNA复制的过程中，同时具有内切酶和连接酶的功能：酶切释放DNA复制过程中产生的螺旋力；在复制完成后，将缺口补上，完成DNA的复制。很多拓扑异构酶无明显特异性结合DNA序列的规律，直到1990年，科学家舒曼在牛痘病毒中发现了一种拓扑异构酶能特异性识别C/TCCTT序列（图2），并对后面序列进行切割和连接，才使得拓扑异构酶用于DNA克隆成为可能。

图2 左图：拓扑异构酶识别特定的序列；右图：拓扑异构酶介导的基因克隆

（Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia  DNA topoisomerase. S Shuman  J. Biol. Chem., Vol. 269, Issue 51, 32678-32684, 12, 1994）

 

EASY克隆就是基于这一原理，将T碱基通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，使拓扑异构酶和载体偶联在一起。当偶联载体与PCR产物进行连接时，PCR产物3`端羟基撞击载体与酶之间的磷酸键，使其断裂，拓扑异构酶利用断键释放的能量发挥连接功能（图3），将片段连接到载体上，同时酶从载体上脱落。连接反应成为一个双分子作用的过程，相对来说片段利用率会更高一些。

图3 PCR产物连接EASY克隆载体原理（图片来源于网络）

 

那么，它作为克隆的方法有哪些优势呢？

由于拓扑异构酶本身的特性，其连接速度非常快，所以EASY克隆的连接时间一般在30 min以内，对于较短些的DNA片段（比如500 bp）最快5 min即可完成连接反应。另外，拓扑异构酶适应的缓冲体系比较广泛，故EASY载体并不需要额外的Buffer，连接时，加入载体和片段即可。由于载体末端偶联有拓扑异构酶，故载体自连率会较T4连接酶介导的DNA克隆低很多，而且可以进行平末端DNA片段直接克隆，无需额外的进行末端加A步骤。总起来说，EASY克隆操作上会更简便，反应更快速，连接更高效。

 图4 2种EASY克隆载体（左边为T载体，右边为平末端载体）

 

拓扑异构酶不仅具有连接酶的功能还具有内切酶的功能，目的片段连接到载体上之后，拓扑异构酶有一定的概率将其再切割下来，整个反应是一个动态平衡的过程。因此，EASY克隆连接片段并不是连接时间越长，效率越高（图5）。

图5 拓扑异构酶切割和连接片段到载体上的动态过程 （Mary R. Stahley and James T. Stivers Biochemistry.2010 April 6: 49(13):2786-2795）

 

在EASY克隆载体的基础上，通过在载体上增加自杀基因，可以使转入自连载体的克隆无法生长，从而提高阳性率，达到“零背景克隆”（接近100%的阳性克隆率）。（图6）

 图6 两种零背景克隆载体

无缝克隆利用类似于同源重组的方法进行连接，引物设计时在片段末端引入重叠序列，可将任意方法线性化后的载体与片段进行连接（图7）。这种方法可以连接一个片段，也可以同时连接多个片段，整个实验过程简单、快速，是进行多片段拼接克隆的不二之选（pEASY^®-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit）。

图7 无缝拼接示意图

 

无缝克隆的方法对于引物的设计有一定的要求。载体与片段间的同源臂设计是有一定原则的，无论载体线性化后是平末端、5`端突出还是3`端突出，目的片段引物都要和载体3`端对齐（图9）。目的片段引物设计有两种方法，第一种方法，同源臂两个片段均分，第二种是同源臂可以放在任意一个片段上（图8）。如果觉得这些设计比较繁琐，也可以使用全式金在线引物设计软件（http://soft.transgen.com.cn）设计引物，方便简单。 

图8 无缝拼接引物设计原则和方法

三种基因克隆的方法均有不同的特点，下表从原理和特点方面对这三种方法进行了比较（表1）。

 表1 3种基因克隆方法的比较

1. 片段处理

在PCR扩增之后，如果扩增成功，会有三种情况：

（1）产物比较单一，没有任何引物二聚体和杂带，对于EASY克隆来说可将扩增产物直接连接载体；对于其它方法则需要对产物先进行纯化再连接；

（2）PCR产物除了目的条带外，还有有引物二聚体，则需要对产物进行纯化后再连接载体；

（3）如果PCR产物有杂带，则需要经过胶回收纯化PCR产物后再连接载体。 

2. 外源片段的准备

PCR注意事项：延伸设置为72 10-20分钟。目的：保证扩增片段完整，有效降低扩增背景；使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤为加A反应；

Taq系列DNA聚合酶扩增（如EasyTaq，TransTaq-T等），使用TA克隆载体；

Pfu系列DNA聚合酶克隆（如EasyPfu，FastPfu等），使用Blunt克隆载体。

对于需要胶回收的片段来说，由于紫外照射（尤其是短波长，比如我们照胶常用的302 nm波长）对dsDNA造成损伤导致克隆效率降低，阳性率减少，突变率增加。建议使用新鲜电泳液，尽量减少紫外照射时间，使用长波紫外线（366 nm以上）。

3. 克隆感受态细胞的选择

 

克隆实验中感受态细胞的选择也是比较重要的，下面的几种感受态细胞是做克隆时常用到的，为大家简单介绍一下它们的特点，便于大家选择。

 

2 常用感受态细胞介绍

注：感受态名称中左边为全式金产品名称，括号内为原始菌株名称。

4. 特殊DNA片段克隆

 

有些DNA片段可能具有一些特殊结构（比如具有高AT、高GC），进行克隆会比较困难，可以通过调整、摸索连接体系和条件（比如65预处理片段），或者换用不同骨架的载体来改善。

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