上期结尾部分提到了三种影响细胞生长状态的因素，其实还有一类较常见的影响细胞生长的因素，且越来越受到人们的重视，这就是支原体污染，由于它的影响比较广泛和复杂，本期全式金生物将对其单独进行介绍。

Fig.1 MDCK cell line infected with M. arginini;  arrows indicate mycoplasmas, dashed arrow indicates microvilli. Figure from Hans G. et al(2002)

支原体污染主要来自于哪里？

支原体的来源非常广泛，常见的来源主要有以下四个：

1. 组织来源：如果实验用到原代细胞，而采集原代细胞的组织中本身就含有支原体，那么所采集和分离到的细胞也会含有支原体。

2. 培养试剂：主要是指血清，由于血清来自于动物，如果动物受到支原体的感染，从中取得的血清也不可避免的含有支原体。不过由于现代血清生产工艺流程成熟，正规厂商出厂前都会对很多指标进行检测（包括支原体），出现问题较少。

3. 人员操作：人员因素是支原体污染的主要来源，由于环境和人唾液中均可能含有支原体，如果操作不规范，很容易会在细胞培养中引入支原体的污染。

4. 细胞间交叉污染：这也是支原体污染的一个主要因素，实验室内和实验之间偶尔可能会互相借用细胞，如果被借用的细胞带有支原体，在没有检测、去除措施的情况下，那么很快支原体就会污染到其它细胞中。

在细胞培养过程中，支原体感染发生率超过50%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。那么细胞污染支原体后，对于我们的实验会有哪些影响？

受支原体污染细胞生长会变慢，状态会变差，虽不会马上使细胞致死，但却会影响细胞内的各种参数，如改变细胞膜抗原性，改变细胞新陈代谢，干扰核酸的合成，改变 DNA 转染效率，导致染色体畸变等，这些影响会造成我们的实验结果不准确，重复性差，甚至得出错误的结论。支原体的污染还会导致已经发表文章的很多实验结果重复不出来或同样的实验得到相反的结论。

因此从2013年开始，业界顶级期刊《Nature》已正式要求投稿的文章如涉及细胞培养，都必须要进行支原体检测（http:// www. nature .com/ authors/ policies/ availability. html）。其它很多杂志，也纷纷效仿，提出了细胞实验中支原体检测的要求。

http://s5/mw690/0039crcIzy7mFyriocc74&690

Fig.2  Resources on cell line identity （http://www.nature.com/authors/policies/availability.html）

如何检测培养细胞中有无支原体的污染？

为保证实验结果的准确性和文章的顺利发表，我们如何检测培养细胞中有无支原体的污染呢？

一般快速检测细胞培养中支原体的方法有DNA染色法（直接法）、PCR法和化学发光法。

1. DNA染色法（直接法）：使用DNA染色试剂（如：Hoechst 33258）对细胞进行染色，由于支原体中的核酸也可以被着色，所以，如果有支原体污染的情况，会在细胞表面或者培养基中发现有小点或者碎片状的荧光，而细胞核的荧光相对会更大更亮，呈椭圆形。这种方法最大的优点就是快速，直观；但是它的灵敏度会比较低，在支原体污染不严重时容易得到模棱两可的结果，只有在污染严重时得到的结果，可靠度才会比较高。

2. PCR法：这种方法是目前最常用的方法，它的检测方式主要有凝胶电泳检测和荧光定量检测。它们的原理都是在支原体16S rRNA基因的保守区设计引物，通过检测支原体基因组的方法来检测细胞中有无支原体的污染。如果有支原体的存在，则在琼脂糖凝胶电泳或者荧光定量扩增时，就可以检测到。这种方法的优点是检测灵敏度高，特异性好，检测速度快。以全式金公司的TransDetect PCR Mycoplasma Detection Kit为例，整个过程从取样到检测，只需要2－3个小时便可能得到检测结果。

http://s6/mw690/0039crcIzy7mFytEAJv25&690

 Fig.3 Sensitivity of TransDetect PCR Mycoplasma Detection Kit

3. 化学发光法：其原理是利用支原体内特有的酶，与提供的底物相互作用，使其中的ADP转化为ATP，荧光素酶可以利用产生的ATP与荧光素酶底物发生反应，产生可检测到的光，光可以被我们使用仪器检测到。如果没有支原体存在，荧光素酶就没有足够的ATP去发生反应产生光，仪器检测到的数值就比较低；如果有支原体存在，就可以使大量的ADP转化为ATP，供荧光素酶发生反应，产生大量的光，仪器检测到的数值就比较高。这种方法的优点是检测的灵敏度高，速度快，而且只能检测活的支原体。以全式金公司的TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit为例，整个过程从取样到检测，只需要30－40 min便可能得到检测结果。

Fig.4 Activity of TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit 

检测到有支原体后，下一步就要考虑如何才能清除这些支原体，才能保证实验结果的准确性和可靠性。支原体对于培养细胞常用的双抗并不敏感；而医学研究表明，大环内酯类，四环素衍生物类以及氟喹诺酮类的抗生素对于支原体的清除具有非常明显的效果，而对细胞的损伤相对较小，如市面上常见的红霉素，土霉素，诺氟沙星等药物均属于以上类型的抗生素。在检测到培养的细胞中有支原体的污染时，可以使用以上类型的抗生素来进行去除，也可以购买商业化的去除试剂，去除周期一般为两周左右。以全式金公司产品为例，就有两种支原体去除试剂——TransSafe Mycoplasma Elimination Reagent （TransMyco-1+2）和TransSafe Mycoplasma Elimination Reagent （TransMyco-3），它们的主要成分分别为大环内酯类，四环素衍生物类和氟喹诺酮类，所针对的支原体类型略有不同，大多数情况下这两种类型的去除试剂可以通用。一般两周内便可以完成支原体的清除。

在确定培养的细胞没有支原体污染后，为了防止支原体污染或者再次污染，除了在人员操作和细胞间管理上进行一定的完善外，还可以在细胞中加入一定量的预防试剂，以在一定程度上避免再次受到支原体的污染。如全式金公司的TransSafe Mycoplasma Prevention Reagent。

这样就可以通过支原体的检测、清除和预防这一系列的流程来保证细胞实验结果更加准确、可靠。