最初接触细胞生物学相关的课题或者项目时，往往不知道从哪些方面去入手研究，如实验如何设计，使用哪些方法，检测哪些指标等。寻找和阅读相关文献是我们最常用的方法，对于有丰富经验的同学来说，相对比较轻松；对于初学者，可能需要花费较多的精力和时间。全式金生物在这里给大家分享一些细胞生物学实验中常用的研究思路和方法，希望对初学者会有所帮助。

下图展示了细胞生物学实验常用的研究思路和方法。

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下面会按照细胞生物学实验的思路，对其中各要素逐个进行梳理。

细胞生物学实验的基础是细胞培养，细胞状态好才有可能供我们使用，去完成下游的实验，比如最常见的细胞转染，药物处理等。那么细胞培养的概念是什么（这里所涉及到的细胞均为动物细胞）。

1. 什么是细胞培养？

指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。

最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。

原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。大体制作流程如下（不同的原代细胞制作过程会略有不同）：

 

（1）取组织，放入平皿中。用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS洗组织2－3次。

（2）剪碎胚体，用用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS振荡洗涤，静置片刻，待胚块沉淀后吸去上清，重复3次。 

（3）加胰酶（终浓度0.625%），置37消化至胚块“起毛”（大组织块边缘似纤毛运动）。

（4）弃上清，加入含小牛血清的Hank’s液，用滴管反复吹打至见不到组织块。 

（5）用200目细胞筛过滤至刻度尖底离心管中，离心10 min。

（6）弃上清，加入少量生长液吹散细胞沉淀，按细胞压积（1:300）加生长液，分装入细胞培养瓶，置培养箱培养。

 

不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。

传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、 293、Vero等细胞。

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2. 细胞的生长周期

每代细胞的生长周期（这里以使用较多的贴壁细胞为例）一般分为游离期，贴壁期，潜伏期，对数生长期，停止期。

游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。

贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。

潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。

对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。

停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。

3. 细胞生长所需要营养条件

细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。

基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K⁺，Na⁺等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。

血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。

如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？

合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum® EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副流感病毒、牛呼肠孤病毒、狂犬病病毒、牛腺病毒、牛细小病毒和支原体的检测，安全可靠。以澳洲健康胎牛血液为原料加工而成，经3 次0.1 μm 微孔滤膜过滤，无支原体污染，内毒素水平极低。同时呢也适用于间充质干细胞的培养。下表列出了使用EQ血清培养过的部分细胞，供大家参考。

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除了基础的培养基和血清以外，在培养细胞的时候可能还会用到一些其它的试剂，比如消化贴壁细胞必备的Trypsin（FG301-01 或FG301-11），常见的缓冲液PBS（FG701-01），双抗Penicillin-Streptomycin（FG101-01）等。

4. 影响细胞生长的因素

对细胞生长影响比较多的点主要有以下三个方面：

（1）细胞的营养来源：主要是指血清和培养基，培养基只要根据细胞种类不同选择不同的基础培养基即可，相对比较简单。血清遇到的问题比较多，我们这里着重介绍一下。

我们实验中用得比较多的血清是胎牛血清，血清是一种非人工的产品，成分复杂，偶尔出现沉淀属于正常现象，这个在各个品牌的血清产品中都有可能出现。这些出现的沉淀主要是蛋白质，盐类和脂肪酸等成分的析出，在我们将血清配制成完全培养基以后，这些成分还有可能再溶解到培养基中，并不会对血清促进细胞生长的作用产生明显的影响。这里要强调一下的是，要把血清中出现的絮状沉淀和血清污染区分清楚，后者是万万不能用的。

在日常使用中，很多情况下都有可能增加血清中的沉淀，比如热灭活、反复冻融、融化中没有摇匀、γ射线照射、长期存放在2-8℃等。说到血清的融化，有必要强调一下，切勿将刚刚从-20℃冰箱里拿出来的血清直接放在室温的或者37℃的水浴，因为在水浴中血清迅速融化，很大的温差极易造成血清产生沉淀。建议血清从-20℃冰箱取出后，于2-8℃解冻过夜，注意溶解过程中必须不时摇动使之溶解均匀。血清融解后，分装成我们需要的小份-20℃长期保存即可。

另一个我们常听到的血清处理方法是热灭活，什么是热灭活呢？热灭活主要是灭活血清中的补体，一般灭活条件为56℃，30分钟处理已解冻的血清。实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。因此若非必需，不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省宝贵时间，更确保血清的质量。但在有些实验中，比如免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞的培养中,推荐使用热灭活血清，因为补体的存在会显著的影响到这些实验的结果。

（2）气体和pH：气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要是氧和二氧化碳。在开放培养时，一般置细胞于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中培养。动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，pH值约在7.2-7.4。我们现在使用的大部分缓冲系统都是碳酸氢钠缓冲系统，结合一定浓度的二氧化碳，可提供更有效的缓冲体系，主要是防止pH值迅速变动。

（3）温度：培养细胞的最适温度相当于各种细胞或组织取材机体的正常温度。人和哺乳动物细胞培养的最适温度为35℃-37℃。如果温度过高或者过低都会对细胞的生长、生存状态有明显的影响。温度不超过39℃时，细胞代谢强度与温度成正比；细胞培养置于39℃-40℃环境中1 h，即受到一定损伤，但仍能恢复；当温度达43℃以上时，许多细胞将死亡。当温度下降到20-30℃时，细胞代谢降低，因而与培养基之间物质交换减少。所以为了保持细胞的良好生长环境，我们尽可能的使它们在适宜的温度下生长。

以上是本期为您介绍的细胞生物学实验整体实验设计中细胞培养部分内容，好的研究思路和方法对我们实验的开展至关重要，今天就同大家分享到这里，我们下期见，祝大家科研顺利！

本文作者：全式技术部 张宏晓